[發明專利]同時檢測乙型肝炎病毒三種核苷酸類似物耐藥位點的方法及其試劑盒

無效

• 申請號: 200910191239.0
• 申請日: 2009-10-27
• 公開（公告）號: CN101812537A
• 公開（公告）日: 2010-08-25
• 發明（設計）人: 黃愛龍;張文露;胡源;賴國旗;劉彥辰;趙麗
• 申請（專利權）人: 重慶醫科大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 重慶市前沿專利事務所 50211
• 代理人: 郭云

技術領域

本發明涉及檢測乙型肝炎病毒耐藥的方法，特別涉及采用反向斑點雜交技術檢測 乙型肝炎病毒對三類核苷酸類似物耐藥的方法，還涉及用于臨床檢驗的試劑盒。

背景技術

乙型肝炎病毒的感染呈世界范圍廣泛流行，尤其我國感染者占到全球的1/3。慢性 感染者中的5％～10％可導致肝癌(HCC)，30％進展為肝硬化，而肝硬化患者中的23％ 會在5年內發生肝功能衰竭。據統計，我國每年用于HBV感染患者的醫療和保健費用 高達1000億人民幣。因此，HBV感染嚴重危害人民健康，造成國民經濟嚴重損失。

抗乙肝病毒藥物治療已被國際上公認為有效治療的關鍵。目前，主要有干擾素類 和核苷類似物(NRTI)兩大類。干擾素類主要通過免疫調節和抗病毒而發揮作用，療 效相對持久，耐藥少，不良反應較明顯，尤其不適合肝功能失代償患者。而核苷酸類似 物(NRTI)，通過抑制逆轉錄酶活性并終止鏈延伸來達到抑制病毒復制的作用。目前， 抗HBV的核苷類似物藥物主要有以下3類：左旋核苷酸類似物，無環核苷磷酸鹽，脫 氧鳥苷類似物，代表藥物分別為：拉米夫定(lamivudine)阿德福韋雙酯(adefovir dipivoxil)恩替卡韋(enticavir)。核苷酸類似物的作用較強，且不良反應少，被廣泛用于 臨床治療，但長期使用極易引發耐藥突變。

HBV為嗜肝DNA病毒，復制速度快，且其復制所必需的DNA聚合酶缺乏嚴格的 矯正機制，使得HBV基因組自身變異率較高，同時，隨著治療時間的延長，在機體和 藥物的選擇壓力下，也會出現不同程度的耐藥突變。臨床實驗表明，任何單一藥物產生 的耐藥會在一定程度上表現出對該族其他藥物的交叉耐藥性，從而可能降低其他族 NRTI治療敏感性。那么，耐藥變異株的出現就會引起HBV?DNA復制反跳、谷丙轉氨 酶ALT活性升高，嚴重影響預后，甚至可能造成新型突變株的傳播，給全球性的公共 衛生帶來隱患。因此，有效和動態的監測HBV對不同藥物的耐藥情況，可以減少耐藥 突變株的形成和藥物間的交叉耐藥，同時對HBV感染者個體化治療方案的選擇有重大 臨床意義。

乙型肝炎病毒是不完整的雙鏈DNA，在DNA聚合酶的作用下，逆轉錄合成HBV?DNA 的負鏈，再互補合成相對應的正鏈DNA，完成HBV基因組復制。而拉米夫定，阿德福韋 酯和恩替卡韋等核苷酸類似物均作用于該逆轉錄這一過程。其中DNA聚合酶的逆轉錄 酶活性區域RT為藥物作用靶點區域，且相關耐藥突變也主要發生在此區域。目前，用 于耐藥突變檢測的方法主要包括直接測序、限制性片段長度多態性分析(RFLP)、單鏈 構象多態性分析(single-strand?conformational?polymorphisms，SSCP)、實時熒光 PCR，以及基于反向雜交原理的基因芯片技術和線性探針分析法等。

(1)PCR產物直接測序法：能夠檢測到整個序列中的幾乎所有可能的突變，但容易 忽略小于準種的20％的低豐度耐藥株序列，且測序結果易受到非特異條帶等的影響， 從而產生高背景，使得結果判讀不準確?？寺〖夹g雖然能彌補上述不足，但需要分析大 量的克隆株，相對耗費人力物力。

(2)限制性片段長度多態性分析(RFLP)：首先對每個已知的耐藥位點設計野生 型和耐藥型的特異性核酸內切酶識別位點，經PCR和酶切后，根據酶切圖譜來反應是否 發生耐藥突變。雖然其檢測靈敏度較高，但是由于每個檢測位點均需要建立一個獨立的 酶切反應體系，操作繁瑣，況且并不是每個耐藥位點都可以找到相應的酶切位點，技術 難度大。

(3)單鏈構象多態性分析(SSCP)：在監測病毒耐藥毒株的出現和動態變化時， 能檢測出單個堿基的突變，但擴增的PCR產物不能太長，最好在150bp左右，而且，如 果點突變發生在擴增片段兩端時，由于點突變引起的空間構象甚微，導致電泳遷移率相 差無幾，易出現假陰性結果。

(4)實時熒光PCR：通過融解溫度的不同檢測HBV不同的耐藥位點突變株，但對于 多位點或相鄰位點的分析比較困難。

(5)基因芯片技術：可以高通量、多位點檢測HBV的耐藥突變，但對擴增產物的 檢測需要特殊儀器和訓練有素的技術人員及多步洗滌、孵育步驟，過程復雜費時。