[發(fā)明專利]一種基于PCR技術(shù)鑒定單拷貝轉(zhuǎn)基因煙草的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910191038.0
• 申請日: 2009-09-30
• 公開（公告）號: CN101760555A
• 公開（公告）日: 2010-06-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 羅克明;宋峰;孫敏
• 申請（專利權(quán)）人: 西南大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 重慶華科專利事務(wù)所 50123
• 代理人: 康海燕

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域中的植物基因工程學(xué)科，涉及在根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草遺傳轉(zhuǎn)化過程中，鑒定單拷貝轉(zhuǎn)基因植株的方法。?

背景技術(shù)

近年來，轉(zhuǎn)基因技術(shù)作為一種常規(guī)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于植物學(xué)各個研究領(lǐng)域。同時，該技術(shù)目前也成為了世界上增加作物產(chǎn)量、改善作物品質(zhì)最重要的手段之一。在植物轉(zhuǎn)基因過程中，根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化是最常見的轉(zhuǎn)化方法，但農(nóng)桿菌攜帶含目的基因的T-DNA片段是隨機插入受體植物的核基因組中的，因此獲得的轉(zhuǎn)基因植株往往含有一個至多個拷貝的外源基因(Spielmann?et?al.，Mol.Gen.Genet.1986，205：34-41.)?，F(xiàn)已證明，多拷貝數(shù)的外源基因在轉(zhuǎn)錄翻譯過程中存在基因沉默的現(xiàn)象，導(dǎo)致其表達不穩(wěn)定(Lechtenberg?et?al.，Plant?J.2003，34：507-517.)。因此，在獲得轉(zhuǎn)基因植株的過程中，鑒別出只含有單個拷貝外源基因的轉(zhuǎn)基因植株是非常必要的，這是開展后續(xù)研究工作的基礎(chǔ)。?

鑒定轉(zhuǎn)基因植物外源基因拷貝數(shù)的方法比較多，主要有以下幾種：(1)Southern雜交分析，該方法是一種經(jīng)典的鑒定轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的分子生物學(xué)技術(shù)，但是它需要花費昂貴的反應(yīng)試劑，以及消耗大量的人力和時間，而且存在多拷貝插入鑒定不準確的缺點(Chen?et?al.，1992；Plant?Cell?Physiol.，33：577-583；Aldemital?and?Hodges，1996，Planta，199：612-617)；(2)基因分離試驗，在鑒定單拷貝外源基因的轉(zhuǎn)基因植株中也是一種很有用的方法，但是其存在?實驗周期長和工作量大的弊端。為了克服上述問題，最近出現(xiàn)的利用實時定量PCR(Quantitative?Real-time?PCR)能比較快速地鑒定轉(zhuǎn)基因植株中外源基因的拷貝數(shù)(Honda?et?al.，J?Exp.Bot.2002，53(373)：1515-1520；Mason?et?al.，BMC?Biotech.，2002，2，20)。由于此方法需要昂貴的儀器和復(fù)雜的數(shù)據(jù)分析，這限制了該方法的廣泛應(yīng)用。最近，Kihara等人報道了一個簡單的PCR方法快速有效地檢測轉(zhuǎn)基因擬南芥中外源基因拷貝數(shù)(Kihara?et?al.，Biosci.Biotechnol.Biochem.，2006，70(7)，1780-1783)。該方法合成兩套退火溫度相同的PCR引物，一套引物特異性擴增外源目的基因，一套引物擴增作為對照的內(nèi)源單拷貝基因。在同一個反應(yīng)中，如果兩套引物擴增的產(chǎn)物量之比為1，表明外源基因為單拷貝插入。利用該技術(shù)可快速地鑒定出單拷貝的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株。?

煙草(Nicotiana?tabacum)為茄科植物，是一種重要的經(jīng)濟作物，同時也做為一種雙子葉模式植物，在植物基因工程領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用。然而，如何快速有效地鑒定出轉(zhuǎn)基因煙草中外源基因的拷貝數(shù)，獲得單拷貝轉(zhuǎn)基因植株，目前還未見相關(guān)方法的報道。?

發(fā)明內(nèi)容

為了克服以往鑒定單拷貝轉(zhuǎn)基因煙草方法成本高、耗時長、效率低等問題，本發(fā)明基于聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)，設(shè)計了一種簡單、高效、低成本鑒定轉(zhuǎn)基因煙草中單拷貝植株的新方法。?

本方法解決其技術(shù)問題所采用的方案是：?

一種基于PCR技術(shù)鑒定單拷貝轉(zhuǎn)基因植株的方法，其包括以下步驟：?

(1)轉(zhuǎn)基因煙草植株DNA的提取?

(2)外源基因和內(nèi)源基因PCR引物的設(shè)計，所述內(nèi)源基因選擇在NCBI公布的煙草核基因組上且已被證明為單拷貝的內(nèi)源基因RNR₂；外源基因為新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II基因NPTII。?

兩對引物應(yīng)滿足以下條件：?

(A)能在相同或相似的退火溫度下指數(shù)擴增?

(B)不能相互結(jié)合?

(C)擴增的目的片段之間不能相互結(jié)合?

(D)目的片段大小應(yīng)具一定差別?

(E)證明外源基因和內(nèi)源基因兩對特異性引物具有相同的擴增效率。?

(4)尋找最佳循環(huán)數(shù)：需要尋找到反應(yīng)的最佳循環(huán)數(shù)，既滿足目的條帶信號清晰可辨的目的，又不至反應(yīng)達到飽和。?

(5)檢測出攜帶單拷貝外源基因的轉(zhuǎn)基因煙草植株：?