[發(fā)明專利]一種基于PCR技術(shù)鑒定單拷貝轉(zhuǎn)基因煙草的方法無效
| 申請?zhí)枺?/td> | 200910191038.0 | 申請日： | 2009-09-30 |
| 公開（公告）號： | CN101760555A | 公開（公告）日： | 2010-06-30 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 羅克明;宋峰;孫敏 | 申請（專利權(quán)）人： | 西南大學(xué) |
| 主分類號： | C12Q1/68 | 分類號： | C12Q1/68 |
| 代理公司： | 重慶華科專利事務(wù)所 50123 | 代理人： | 康海燕 |
| 地址： | 400715*** | 國省代碼： | 重慶;85 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 基于 pcr 技術(shù) 鑒定 拷貝 轉(zhuǎn)基因 煙草 方法 | ||
1.一種基于PCR技術(shù)鑒定單拷貝T2代轉(zhuǎn)基因煙草植株的方法，其特征 在于包括以下步驟：
(1)T2代轉(zhuǎn)基因煙草植株基因組DNA的提??；
(2)外源基因和內(nèi)源基因PCR引物的設(shè)計(jì)，所述內(nèi)源基因選擇在NCBI 公布的煙草核基因組上且已被證明為單拷貝的內(nèi)源基因；
(3)證明外源基因和內(nèi)源基因兩對特異性引物具有相同的擴(kuò)增效率；
(4)尋找最佳循環(huán)數(shù)；
(5)檢測出攜帶單拷貝外源基因的T2代轉(zhuǎn)基因煙草植株：
以煙草的核糖核酸酸還原酶RNR2為內(nèi)源基因，以新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶NPT II為檢測外源基因拷貝數(shù)的標(biāo)記基因，通過RNR2基因的特異性引物，上游引 物為：5’-AGAAGAGCCTTTGCTGGCC-3’，下游引物為： 5’-CCAACAATCTATCAGCCACG-3’，以及NPT?II基因的特異性引物，上游引 物為：5’-ACAATCGGCTGCTCTGATG-3’，下游引物為： 5’-TCAGAAGAACTCGTCAAGAAG-3’，經(jīng)過34個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，得到片段大 小分別為791bp和741bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳 后成像，分析目的條帶灰度，當(dāng)內(nèi)源基因與外源基因的目的條帶灰度比為1 時(shí)，所檢測的T2代轉(zhuǎn)基因植株即為含有單拷貝外源基因的植株。
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