[發明專利]一種利用基因的協同作用培育抗黃萎病棉花的方法及其應用

無效

• 申請號: 200910190967.X
• 申請日: 2009-09-24
• 公開（公告）號: CN101717784A
• 公開（公告）日: 2010-06-02
• 發明（設計）人: 李先碧;裴炎;李德謀;肖月華;羅明;侯磊;宋水清;范艷華;羅小英
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H1/02
• 代理公司: 重慶博凱知識產權代理有限公司 50212
• 代理人: 張先蕓

技術領域

本發明屬于植物基因工程領域。主要涉及利用不同來源基因間的協同作用，培育抗黃萎病轉基因棉花的方法。

技術背景

作物病害是作物高產穩產的主要障礙之一，常常引起作物產品品質下降，甚至產生一些對人類具有毒副作物的代謝物質。全世界每年因病害造成的作物減產超過15％，直接經濟損失達300～500億美元(李潤植等，2001；Osusky等，2000)。培育和推廣應用抗病品種是作物病害綜合防治最經濟有效的措施。由于病原菌變異迅速，植物抗性資源有限以及常規育種方法耗時費力，培育的抗病品種遠不能滿足生產需要。利用現代生物技術分離、克隆和轉化抗性基因，可有效克服常規育種的不足，且基因來源廣泛、不受抗源親緣關系限制，一次克隆可用于多次轉化。此外，將某些抗病基因轉入植物中，還可以提高植物獲得性系統抗病能力和對病原菌的免疫能力。通過這種方法獲得的轉基因植物抗性不易喪失，抗性基因容易轉育(Cornelissen等，1993)。因此，基因工程技術已成為植物抗病育種的重要途徑。

幾丁質酶是一種水解酶，廣泛存在于植物和微生物，具有降解幾丁質的作用。幾丁質是植物病原真菌中絕大多數真菌細胞壁的主要成分，而在植物中還未發現幾丁質酶的底物，因此，幾丁質酶在防御植物病原真菌的侵害中具有重要作用。自1991年，Broglie等首次報道轉幾丁質酶基因植物能提高對真菌病害的抗性以來，幾丁質酶基因便倍受關注。但是，至今還沒有利用幾丁酶基因獲得可利用的抗病轉基因材料的報道。

抗菌蛋白(AMP，antimicrobial?protein)是一類由生物產生的具有抗菌活性的蛋白或多肽，廣泛分布于動物、植物和微生物中，具有抗菌譜廣、抗菌活性高和抗性持久等特點。抗菌肽的抗菌機制特別，多以在膜上形成孔道導致細胞內容物泄漏的方式摧毀病原菌，致使病原菌難以產生抗性。大量的研究表明，在植物中表達異源的抗菌蛋白基因能增強植物的抗病性(AlanAR，2004；Cary?JW，2000；Maria?Coca，2006)。在提高植物抗病性的策略應用上，運用最廣泛的是利用來自植物的抗菌蛋白基因提高不同植物的抗性。目前，抗菌蛋白基因在提高植物抗病性方面的研究已涉及煙草、水稻、小麥、棉花、油菜、大豆、葡萄、梨、蘋果、玫瑰、楊樹、橄欖等多種植物。但是，在植物中組成型高量表達異源蛋白或多肽常常對植株生長不利，易引起植株生長發育異常或不育。表達偏低時，植株生長發育正常但是抗性提高不明顯。因此，單純組成型表達抗菌蛋白基因，也難以獲得可利用的轉基因抗病材料。

作為重要經濟作物的棉花在我國國民經濟中占有重要地位。但是棉花生產常年受到多種病害的威脅，特別是棉花黃萎病仍是棉花生產中最具毀滅性的病害之一。因黃萎病是土傳維管束病害，難以利用化學藥劑進行防治。目前我國棉花黃萎病的發病面積已占植棉總面積的50％以上，每年損失皮棉7.5-10萬噸，直接經濟損失16-20億元，已成為當前實現棉花高產、穩產的主要障礙因素，但是至今生產上沒有找到有效的防治措施。生產實踐證明，種植抗病品種是唯一經濟有效的防治手段。我國育種專家經過幾十年的努力，利用常規育種手段，獲得了一些對黃萎病具有一定抗病能力的地方品種，但是由于黃萎病菌變異快、小種多，具有明顯的致病力分化，針對黃萎病菌這種特性的廣譜抗性品種基本沒有，因此就存在著在一個地區表現為抗病的品種，到另一個不同生理和地理條件下，可能出現抗病性喪失的問題。另一方面，由于陸地棉栽培種內缺乏高抗黃萎病的抗源，直接導致了我國棉花抗黃萎病育種進程緩慢，特別是抗落葉型黃萎病育種基本沒有進展。此外，不同地域種子交流導致病原菌在地方上的種類越來越多，形成了復合種群。不同地域黃萎病菌致病力的分化和提高，強致病力菌系的出現是造成棉花黃萎病逐年加重的主要原因之一。為此，解決生產中抗黃萎病資源缺乏的問題和尋找新的抗病育種方法已迫在眉睫，急需獲得具有廣譜和持久抗性的抗源以減輕棉花生產中黃萎病造成的巨大損失。

利用基因工程改良棉花的抗病性也已逐漸成為棉花病害防治的一條重要途徑。但是將單個幾丁酶基因或抗菌蛋白基因轉入棉花還沒有獲得滿足棉花生產要求的抗病材料。利用基因間的協同作用提高棉花對黃萎病的抗性已有報道。但是，這方面的研究主要集中在幾丁質酶基因和葡聚糖酶基因間的協同作用(吳家和和張獻龍等，2004)，而未見幾丁酶基因和抗菌蛋白基因間協同作用提高轉基因棉花對黃萎病抗性的報道。

發明內容

本發明的主要目的是提供一種簡便易行，效果顯著，能為棉花抗黃萎病育種，特別是抗落葉型黃萎病育種提供新的抗源，利用基因的協同作用培育抗黃萎病棉花的方法及其應用。