[發明專利]水泡性口炎病毒快速檢測試紙條及其制作方法

有效

• 申請號: 200910190437.5
• 申請日: 2009-09-16
• 公開（公告）號: CN101666800A
• 公開（公告）日: 2010-03-10
• 發明（設計）人: 花群義;阮周曦;楊俊興;楊云慶;曾少靈;張彩虹;孫潔;呂建強;秦智鋒;陶虹
• 申請（專利權）人: 花群義
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/577;G01N33/532
• 代理公司: 深圳市中知專利商標代理有限公司
• 代理人: 成義生;羅永前

【技術領域】

本發明涉及生物技術領域，特別是涉及一種用于檢測水泡性口炎病毒 抗原的快速檢測試紙條及其制作方法。

【背景技術】

水泡性口炎是由彈狀病毒科水泡病毒屬的水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis?Virus，VSV)引起的人畜共患的重大動物疫病。其包括印第安 納(Indiana，IN型)和新澤西(New?Jersey，NJ型)兩個血清型。牛、 豬、馬、羊和其它多種野生動物可感染，人感染后出現類似流感和登革熱 的癥狀。臨床癥狀與口蹄疫(FMD)不易區別，該病的存在及流行直接影響 人類及動物健康。水泡性口炎病毒的基因組編碼包含N，NS，M，G，L等5 種病毒蛋白，其中，N蛋白是該病毒核衣殼的主要蛋白，為VSV的群特異性 抗原。1950年證實此病為人畜共患病。目前，水泡性口炎病毒最常用的診 斷方法包括病毒分離鑒定、病毒中和試驗(VN)、補體結合試驗(CF)、液 相阻斷ELISA(LP-ELISA)、競爭酶聯免疫吸附試驗(c-ELISA)、反轉錄聚 合酶鏈反應(RT-PCR)等。其中，病毒中和試驗(VN)和補體結合試驗(CF) 兩種方法因試驗復雜、麻煩、耗時、不安全、需在生物安全三級(P3)實 驗室內進行，且有時產生非特異性反應，應用受到限制，且其它診斷方法 也各有其一定的局限性而無法用于快速診斷。目前，國內口岸檢疫中急需 VS的快速檢測方法和試劑。研制快速、便捷、適合于口岸檢疫和現場診斷 的檢測試紙條，在水泡性口炎的快速診斷、檢疫和流行病學調查中具有更 重要的應用價值。

【發明內容】

本發明旨在解決水泡性口炎病毒抗原的快速檢測問題，而提供一種無 須使用特殊的設備和專門的技術人員，即可直接、快速對水泡性口炎病毒 抗原做出檢測的水泡性口炎病毒快速檢測試紙條。

本發明還提供了該水泡性口炎病毒快速檢測試紙條的制作方法。

為實現上述目的，本發明提供一種水泡性口炎病毒快速檢測試紙條， 該試紙條包括：

基板，它是由不透水材料制成的條形板狀體；

樣品吸收墊，它由多孔纖維制成，該樣品吸收墊內吸附有膠體金標記 的水泡性口炎病毒的單克隆抗體；

硝酸纖維膜，其上設有檢測線和對照線，其中，檢測線上包被或噴附 有水泡性口炎病毒多克隆抗體，對照線上包被或噴附有蛋白質A；

吸水墊，且

所述吸收墊、硝酸纖維膜及吸水墊沿基板的長度方向依次設置在基板 板面上。

形成基板的不透水材料為聚氯乙烯。

形成樣品吸收墊的多孔纖維為玻璃纖維。

本發明還提供了所述水泡性口炎病毒快速檢測試紙條的制作方法，該方 法包括如下步驟：

a、制備水泡性口炎病毒單克隆抗體，其制備過程為：(1)水泡性口炎 病毒的純化，用水泡性口炎病毒(VSV)接種BHK-21細胞長成單層，收獲 的細胞培養病毒液反復凍融3次，以8000轉/分離心30分鐘，取上清液， 超速離心和不連續蔗糖密度梯度離心，收獲提純的病毒條帶，用核酸蛋白 分析儀測定蛋白含量為2.4g/L，-20℃保存備用；(2)用提純的水泡性口炎 抗原加等體積弗氏完全佐劑乳化，和弗氏不完全佐劑乳化，免疫BALB/c小 鼠三次；(3)取免疫小鼠的脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞在50％聚乙二醇 (MW4000)融合劑下融合，HAT篩選培養基篩選雜交瘤細胞，用間接ELISA 方法檢測分泌抗VSV的陽性孔；(4)用有限稀釋法進行細胞克隆，經間接 ELISA篩選陽性克隆，獲得能穩定傳代并分泌抗VSV的特異性單克隆抗體的 雜交瘤細胞；(5)將獲得的分泌抗VSV的特異性單克隆抗體雜交瘤細胞注 射入BALB/c小鼠腹腔制備單抗腹水；(6)采集單克隆抗體腹水，測定抗體 效價、蛋白含量和親和力，腹水ELISA效價高達為1∶1024000，用核酸蛋 白分析儀測定純化腹水IgG的含量為1.97g/L，親和力分常數高達5.41 ×10⁷mol/L。用間接ELISA方法鑒定制備的單克隆抗體僅與水泡性口炎病毒 有特異性免疫反應，而與其它相關病毒(如BTV、AKV、EHDV、PPRV等)沒 有任何免疫反應。