[發(fā)明專利]混合石蠟、PCR反應(yīng)試劑的保存方法以及反應(yīng)試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910190112.7
• 申請日: 2009-09-08
• 公開（公告）號: CN101665816A
• 公開（公告）日: 2010-03-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張鵬;汪再興;吳炳義;彭論;嚴(yán)瓊英
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳市生科源技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12P19/34
• 分類號: C12P19/34;C12Q1/68
• 代理公司: 深圳中一專利商標(biāo)事務(wù)所
• 代理人: 張全文

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種采用混合石蠟對PCR反應(yīng)試劑進(jìn)行保存的方法以及含有 該混合石蠟的PCR反應(yīng)試劑盒。

背景技術(shù)

實時熒光定量PCR(Real?Time?Polymerase?Chain?Reaction，Real?Time?PCR 實時PCR)技術(shù)是通過對PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時檢測， 從而實現(xiàn)對起始模板定量或定性分析的方法。目前在基礎(chǔ)科學(xué)研究、臨床診斷、 疾病研究及藥物研發(fā)等領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用。其基本原理為：在PCR反應(yīng)體系中 引入一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷積累，熒光 信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光信號強度，這樣就可 以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，得到一條熒光擴增曲線圖，在曲線指 數(shù)擴增階段，PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，可進(jìn)行定 量分析。但是在一般的PCR試劑盒中(反應(yīng)液體積一般為10μl～100μl)，由于 反應(yīng)液體積較少，在高溫條件或長途運輸過程中，又易因蒸發(fā)而體積減少，造 成反應(yīng)液體積和成分的變化，從而影響檢測結(jié)果；并且長時間保存后，反應(yīng)液 中的Taq酶(耐熱性多聚酶)、UNG酶(尿嘧啶DNA糖基酶)易失活也影響擴 增效率。

如果能采用一種方法，能保證少量的反應(yīng)液體積在高溫或運輸?shù)臈l件下不 發(fā)生體積和成分的變化，并且能長時間的保持Taq酶的活性，這將給PCR試劑 盒的使用帶來更大的方便。為解決上述問題，目前有兩種方法，一種是使用植 物油作為熱啟動PCR反應(yīng)中的蒸汽障礙，以減少溶劑揮發(fā)，但這種方法并不能 解決長時間保持Taq酶活性的問題，另一種是采用固體石蠟將PCR反應(yīng)中的酶 與其他成分隔離，創(chuàng)造了更多的實用和有效的熱啟動PCR方法，但現(xiàn)有固體 石蠟熔點太高，約為50～70℃，而且在-20℃的條件下，PCR反應(yīng)試劑只能保存 1～2周。另外，若PCR反應(yīng)體系中還含有UNG酶，UNG酶適合的作用溫度為 37～50℃，現(xiàn)有固體石蠟熔點太高，若要熔化，需要加熱到50℃以上，影響了 UNG酶在PCR反應(yīng)液中發(fā)揮防污染的作用，從而可能會影響實驗結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明實施例的第一目的在于提供一種利用上述混合石蠟進(jìn)行PCR反應(yīng) 試劑的保存方法。

本發(fā)明實施例的第二目的在于提供一種含有上述混合石蠟的PCR反應(yīng)試 劑盒。

本發(fā)明實施例的PCR反應(yīng)試劑的保存方法，PCR反應(yīng)試劑中含有酶和其它 必要成份，該方法為利用上述混合石蠟將PCR反應(yīng)試劑中的酶與其他成份隔 離，該混合石蠟由液體石蠟(Liquid?Paraffin)和熔化后的固體石蠟 (Paraffin?wax)均勻混合而成，其中，固體石蠟選自熔點高于50℃的固體石蠟， 固體石蠟和液體石蠟的比值為1∶4～1∶12(w/v)。

本發(fā)明實施例的PCR反應(yīng)試劑盒，包括反應(yīng)容器及置于反應(yīng)容器中的反 應(yīng)液，所述反應(yīng)液包括酶和其它必要成份，該PCR反應(yīng)試劑盒中還包括用于將 反應(yīng)液中酶和其它成份隔離的混合石蠟，該混合石蠟由液體石蠟(Liquid? Paraffin)和熔化后的固體石蠟(Paraffin?wax)均勻混合而成，其中，固體石 蠟選自熔點高于50℃的固體石蠟，固體石蠟和液體石蠟的比值為1∶4～1∶12 (w/v)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，上述技術(shù)方案采用熔點高于50℃的固體石蠟熔化后和液 體石蠟按一定比例混合配制成一種混合石蠟，經(jīng)過測試(參見具體實施例)， 該混合石蠟熔點在27～38℃之間，用于將PCR反應(yīng)液中酶和其它成份隔離，熔 點適中，在-20℃的條件下PCR反應(yīng)試劑可保存半年。若PCR反應(yīng)體系中還含 有UNG酶，當(dāng)需要熔化石蠟，使酶和其它成份混合時，無須加熱到50℃或以 上，不會影響UNG酶在PCR反應(yīng)液中發(fā)揮防污染作用，從而不會因此而對實 驗結(jié)果產(chǎn)生影響。此外，本發(fā)明實施例的混合石蠟制造方法簡單，成本低。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例提供的PCR反應(yīng)試劑中加入石蠟后對基因1擴增的 Ct值影響

圖2是本發(fā)明實施例提供的PCR反應(yīng)試劑中加入石蠟后對基因2擴增的 Ct值影響

圖3是是本發(fā)明實施例6混合石蠟的質(zhì)譜圖。

具體實施方式