[發(fā)明專利]用于核酸PCR產(chǎn)物直接測序的測序引物和測序方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910189778.0
• 申請日: 2009-08-28
• 公開（公告）號: CN101638691A
• 公開（公告）日: 2010-02-03
• 發(fā)明（設計）人: 陸學東
• 申請（專利權）人: 陸學東
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/70;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 深圳市博銳專利事務所
• 代理人: 張 明

技術領域

本發(fā)明涉及核酸測序領域，尤其涉及一種用于核酸PCR產(chǎn)物直接測 序的測序引物和測序方法。

背景技術

PCR產(chǎn)物測序大多采用傳統(tǒng)克隆測序技術，包括：1)PCR產(chǎn)物與質 粒載體連接；2)連接產(chǎn)物轉化細菌；3)細菌培養(yǎng)；4)模板制備等繁 瑣步驟，操作麻煩且耗時長。

PCR產(chǎn)物也可以采用直接測序的方法進行測序，目前最常用的PCR 產(chǎn)物直接測序方法仍是Sanger雙脫氧核苷酸介導的鏈終止法，與普通 的PCR反應相比，由于鏈終止法的測序反應依賴于由單向引物與模板特 異結合后引發(fā)的線性擴增，因而對測序模板和引物要求非常嚴格。該方 法中影響PCR產(chǎn)物直接測序成敗的關鍵因素包括：1)測序模板的質量； 2)測序引物的特異性和擴增效率。模板的質量可以通過PCR產(chǎn)物切膠 回收純化、SAP-Exon?I純化、乙醇/醋酸鈉純化等多種方法加以控制， 從而得到高質量的特異性模板。然而，由于PCR產(chǎn)物的多樣性，使得測 序引物的設計和選擇一直是困擾PCR產(chǎn)物直接測序的一個問題。并非所 有的PCR擴增良好的引物都能用于測序反應，如簡并引物、隨機引物、 過長的引物(大于24bp)、自身易形成二級結構的引物、純度不高的引 物等等，如果簡單地將常規(guī)的PCR引物直接用于測序常常會導致測序結 果不理想或測序反應失敗。另需要根據(jù)不同的PCR產(chǎn)物重新設計測序引 物，但會造成測序周期的延長和成本的增加。

發(fā)明內容

為解決上述問題，本發(fā)明的主要目的在于提供用于核酸PCR產(chǎn)物直 接測序的測序引物，所述測序引物適用范圍廣。

本發(fā)明的另一個目的在于提供高效、穩(wěn)定、快捷的用于核酸PCR產(chǎn) 物直接測序的測序方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：

用于核酸PCR產(chǎn)物直接測序的測序引物，所述測序引物的堿基序列 如SEQ?ID?NO：1和2所示。

用于核酸PCR產(chǎn)物直接測序的測序方法，包括以下步驟：

1)根據(jù)待檢測的目標核酸序列設計并合成一對擴增引物，所述擴 增引物包括根據(jù)目標核酸序列設計的特異性引物序列和位于特異性引 物5’端的測序引物序列，合成一對測序引物；

2)采用所述擴增引物對待測樣品進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn) 物；

3)純化所述PCR擴增產(chǎn)物，得到純化的測序反應模板；

4)用純化的測序反應模板，以所述測序引物進行測序反應，得到 測序反應產(chǎn)物；

5)純化所述測序反應產(chǎn)物；

6)對純化的測序反應產(chǎn)物進行序列測定。

所述測序引物的堿基序列如SEQ?ID?NO：1和2所示。

所述步驟3)具體為：PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后切下 待測目標核苷酸目標擴增片段，經(jīng)凝膠純化試劑盒純化，得到純化的測 序反應模板。

本發(fā)明所述用于核酸PCR產(chǎn)物直接測序的測序引物，經(jīng)GenBank中 BLAST比對結果顯示該通用引物序列不與數(shù)據(jù)庫中已知的常見致病性微 生物、人類及其他哺乳類生物常見基因核酸序列具有完全同源性，不會 引起非特異的測序反應，測序結果可以特異性地反映出序列的真實堿基 組成，所以進行病原微生物快速篩查和鑒定、遺傳性疾病的分子診斷和 單核苷酸多態(tài)性研究，都可以利用本申請所述測序引物。

本發(fā)明所述用于核酸PCR產(chǎn)物直接測序的測序方法，不需將待測PCR 產(chǎn)物插入質粒載體，而直接對PCR產(chǎn)物進行核酸序列測定。與傳統(tǒng)克隆 測序技術相比，省去為測序而反復進行的分子克隆、細菌培養(yǎng)和模板制 備等繁瑣步驟，具有快速、簡便、經(jīng)濟，并能更好地反映模板的真實情 況的優(yōu)點，因而可被廣泛地應用于基因突變檢測、遺傳性疾病診斷、單 核苷酸多態(tài)性分析、病原微生物快速檢測和鑒定等領域。

附圖說明

圖1是HBoV陽性標本PCR擴增產(chǎn)物電泳圖，圖中M為DNA標準帶， 3、6為HBoV陽性標本，10為陰性對照，1、2、4、5、7、8、9為HBoV 陰性標本。

圖2A和2B是人類博卡病毒PCR陽性產(chǎn)物測序圖。

圖3是四種腹瀉病毒陽性標本PCR擴增產(chǎn)物電泳圖，圖中M為DNA 標準帶，1、2為RV陽性標本，3、4為NV陽性標本，5、6為EAV陽性 標本，7為As?tV陽性標本，8為陽性對照，9為陰性對照。

圖4是四種病毒PCR陽性產(chǎn)物測序圖。

具體實施方式