[發(fā)明專利]一種制備尿激酶的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910186618.0
• 申請日: 2009-12-07
• 公開（公告）號: CN101701215A
• 公開（公告）日: 2010-05-05
• 發(fā)明（設計）人: 張志武;劉蘭花;曾英;朱月華;楊益輝
• 申請（專利權(quán)）人: 南昌市萬華生化藥業(yè)有限公司
• 主分類號: C12N9/72
• 分類號: C12N9/72
• 代理公司: 南昌洪達專利事務所 36111
• 代理人: 劉凌峰

技術(shù)領域

本發(fā)明涉及一種制備尿激酶的方法，尤其涉及一種親和膜色譜技術(shù)和親和層析技術(shù)制備尿激酶的方法。

背景技術(shù)

尿激酶，簡稱UK，是人體腎細胞產(chǎn)生的一種堿性絲氨酸蛋白酶，絲氨酸和組氨酸是酶活性中心的必需氨基酸。其主要存在于人及哺乳動物的尿中，人尿源尿激酶主要有天然高分子量尿激酶(54000Dal)和低分子量尿激酶(33000Dal)兩種，高分子量尿激酶溶解血栓的臨床效果比低分子量的尿激酶約高3倍，國際上把尿激酶的相對分子量作為質(zhì)量標準的重要指標之一。臨床上主要用于治療急性心肌梗塞、急性腦血栓形成、腦血管栓塞、血栓性閉塞性疾病、肺栓塞以及視網(wǎng)膜中央靜脈血栓形成。

尿激酶制備方法目前主要有離子交換層析法，凝膠分子篩法、免疫親和層析和對氨基苯甲脒-Sepharose親和層析等。如：陳祥勝等報道了采用苯甲脒瓊脂糖凝膠親和層析從尿激酶粗品中精制尿激酶，比活27938IU/mg·pr，活性回收率62.96％，純化倍數(shù)4.03倍；祝一鋒等報道了采用SephadexG-50凝膠過濾、CM-Sephadex?C-50、硫酸銨沉淀以及Bio-Gel?P-30凝膠過濾等制備尿激酶精品，比活34080IU/mg·pr，活性回收率60％左右，純化倍數(shù)50倍。沈金玉等報道了采用免疫親和層析從尿激酶粗品精制尿激酶。離子交換和凝膠過濾純化效率低下，難以獲得高純度的尿激酶精品；免疫親和層析純化尿激酶可獲得較高純度的尿激酶精品，但由于免疫親和層析需使用生物配基，價格昂貴，很難獲得工業(yè)化生產(chǎn)使用的配基；對氨基苯甲脒-Sepharose作為一種較好的尿激酶精品精制方法，但也必須同其他方法一起使用，而且必須在提取過程中多次使用才能獲得高質(zhì)量的尿激酶，多次使用造成生產(chǎn)成本極高、收率低，生產(chǎn)周期長。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種以尿激酶粗品為原料制備尿激酶的方法，該方法生產(chǎn)工藝時間短，易于工業(yè)化生產(chǎn)，產(chǎn)品質(zhì)量高，生產(chǎn)成本低。

本發(fā)明是這樣來實現(xiàn)的，首先尿激酶粗品經(jīng)溶解、離心或過濾，體積較大時超濾濃縮等步驟獲得的澄清溶液，調(diào)電導率，使其與D160陽離子樹脂層析柱使用的平衡液電導率一致，再上裝有D160陽離子樹脂層析柱吸附，再洗滌、洗脫，得到的洗脫液上親和膜純化柱，經(jīng)洗滌、洗脫得到的洗脫液上親和層析柱，經(jīng)洗滌、洗脫、過濾得到的濾液進行冷凍干燥，最后得到尿激酶。其具體制備方法如下：

(1)取一定量的尿激酶粗品(生物效價30000～50000IU/g，比活300～600IU/g·pr)，用8～10倍尿激酶粗品量(體積與重量比)的pH6.0，0.1mol/L磷酸緩沖液分2～3次加入溶解，每次攪拌溶解0.5～1.0小時，然后離心或過濾，合并上清或濾液，體積較大時進行超濾濃縮，得到的澄清溶液備用；

(2)將步驟(1)得到的澄清溶液調(diào)節(jié)電導率，使其與D160陽離子樹脂層析柱使用的平衡液電導率一致，再上用含0.15～0.30mol/L氯化鈉的pH6.0，0.1mol/L磷酸緩沖液平衡的D160陽離子樹脂層析柱，然后用含0.15～0.30mol/L氯化鈉的pH6.0，0.1mol/L磷酸緩沖液洗滌；最后用pH10，1～3％氨水進行洗脫，收集洗脫活性峰；

(3)將步驟(2)收集得到的洗脫活性峰用醋酸調(diào)pH7.2，然后上親和膜純化柱，用含0.45～0.60mol/L氯化鈉的pH7.2，0.1mol/L磷酸緩沖液洗滌，再用含0.25～0.35mol/L氯化鈉的pH3.5～4.5，0.1mol/L醋酸緩沖液洗脫，收集洗脫活性峰；

(4)將步驟(3)收集得到的洗脫活性峰用醋酸調(diào)pH7.2，然后上親和層析柱，用含1.0～2.0mol/L氯化鈉的pH7.2，0.1mol/L磷酸緩沖液洗滌，再用含0.35～0.45mol/L氯化鈉的pH3.5～4.5，0.1mol/L醋酸緩沖液洗脫，收集洗脫活性峰，過濾，最后進行冷凍干燥，得到尿激酶。

本發(fā)明利用D160陽離子樹脂吸附法，親和膜色譜法與親和層析法等結(jié)合使用，以尿激酶粗品為原料制備尿激酶，所得到的尿激酶質(zhì)量優(yōu)于現(xiàn)有國內(nèi)水平，尿激酶比活可達到150,000IU/mg·pr以上，高分子尿激酶相對含量可達到96％以上，尿激酶生物活性回收率可達到65％。本方法解決了現(xiàn)有尿激酶制備方法普遍存在的操作繁瑣、產(chǎn)品質(zhì)量差，收率低和生產(chǎn)成本高等問題。

具體實施方式

實施例1：