[發(fā)明專利]一種適用于底泥中微生物群落結(jié)構(gòu)分析的DNA提取方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910180630.0
• 申請日: 2009-10-26
• 公開（公告）號: CN101696410A
• 公開（公告）日: 2010-04-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙大勇
• 申請（專利權(quán)）人: 河海大學(xué)
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司 32200
• 代理人: 李紀(jì)昌

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于環(huán)境微生物生態(tài)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種適用于底泥中微生物 群落結(jié)構(gòu)分析的DNA提取方法。

背景技術(shù)

河流或湖泊中的底泥是生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，也是大量微生物類群的棲 息地，這些微生物類群在湖泊進(jìn)化演替以及營養(yǎng)元素循環(huán)等方面發(fā)揮著重要的作 用。當(dāng)前，有關(guān)底泥中的微生物群落結(jié)構(gòu)組成的研究已成為微生物生態(tài)學(xué)研究中 的熱點(diǎn)領(lǐng)域。但是，由于自然界中存在的許多微生物不可培養(yǎng)，依靠傳統(tǒng)的顯微 鏡觀察和分離培養(yǎng)來研究微生物的方法難以快速、全面的對湖泊沉積物中的微生 物進(jìn)行研究。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，產(chǎn)生了一些新的微生物生態(tài) 學(xué)研究方法，如：自動核糖體基因間隙分析(Automated?ribosomal?intergenic spacer?analysis，ARISA)，變性梯度凝膠電泳(Denaturing?gradient?gel electrophoresis，DGGE)以及末端限制性片段長度多態(tài)性(Terminal?restriction fragment?length?polymorphisms，T-RFLP)等，這些方法的共同之處是突破了原 有的微生物分離培養(yǎng)的過程限制，能夠更加全面的分析自然界中存在的各種微生 物。另外，這些基于核酸的分子生物學(xué)技術(shù)一般需要先從底泥中提取出DNA，然 后再進(jìn)行進(jìn)一步的分子生物學(xué)研究。因此，DNA提取質(zhì)量的好壞，會直接影響到 微生物群落結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果。通常底泥成分復(fù)雜，難以直接提取到高濃度、高質(zhì) 量的DNA。另外，底泥中包含的腐質(zhì)酸、重金屬等物質(zhì)會干擾后續(xù)的PCR反 應(yīng)，必須在DNA提取階段予以去除。目前大多數(shù)學(xué)者使用的DNA提取方法有的 無法有效去除底泥中的腐質(zhì)酸等干擾物質(zhì)，給后續(xù)的PCR擴(kuò)增帶來困難，有的需 要使用高成本的核酸吸附柱。因此，探索簡便、高效、低成本的DNA提取方法 仍然是微生物生態(tài)學(xué)研究所面臨的難題。

發(fā)明內(nèi)容

技術(shù)問題：本發(fā)明提供了一種從底泥中提取DNA的簡便、高效的方法，可 直接用于底泥中微生物群落結(jié)構(gòu)的分析。

技術(shù)方案：一種底泥中微生物群落結(jié)構(gòu)分析的DNA提取方法，提取步驟 為：

a.用TENP?buffer清洗底泥樣品，將清洗好的底泥樣品懸浮于PBS buffer中；

b.將經(jīng)步驟a預(yù)處理的底泥樣品在-80℃和65℃反復(fù)凍溶后加入溶菌 酶，在37℃水浴1h，所述溶菌酶最終濃度為1mg/mL；

c.向底泥樣品中加入蛋白酶K和十二烷基磺酸鈉，在55℃水浴1.5h， 所述蛋白酶K最終濃度為0.2mg/mL，所述十二烷基磺酸鈉最終濃度 為1％(w/v)；

d.步驟c所得樣品在室溫下離心后取上清液，向其中加入等體積的酚∶ 氯仿∶異戊醇混合液，振蕩混勻，所述混合液中各物質(zhì)的體積比為 25∶24∶1；

e.步驟d所得樣品室溫下離心后取液相，向液相中加入等體積的氯仿∶ 異戊醇混合液，混合液中氯仿∶異戊醇的體積比為24∶1；

f.步驟e所得樣品室溫下離心后取液相，向液相中加入預(yù)冷的異丙醇 在-20℃沉淀2h；

g.步驟f所得樣品在4℃條件下離心去上清，向沉淀中加入預(yù)冷的乙醇 洗滌沉淀三次，再離心去乙醇；

h.將樣品在空氣中自然風(fēng)干，用TE緩沖液溶解DNA保存于-20℃。