[發(fā)明專利]一種適用于底泥中微生物群落結構分析的DNA提取方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910180630.0
• 申請日: 2009-10-26
• 公開（公告）號: CN101696410A
• 公開（公告）日: 2010-04-21
• 發(fā)明（設計）人: 趙大勇
• 申請（專利權）人: 河海大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 李紀昌

1.一種底泥中微生物群落結構分析的DNA提取方法，其特征在于提取步驟為：稱取0.5g濕重的底泥樣品置于5mL滅菌后的離心管中，加入3mLTENP?buffer，所述TENP?buffer的配方為50mM?Tris，200mM?EDTA，100mM?NaCl，0.01g/mL?PVPP，pH10.0，漩渦振蕩8min，10000rpm離心5min，棄上清，在沉淀中再加3mL?TENP?buffer，按上述方法再洗滌兩次，最后加3mL的PBS?buffer，所述PBS?buffer配方為8g?NaCl，0.2g?KCl，1.44g?Na₂HPO₄，0.24g?KH₂PO₄，溶于1L水中，pH7.4；將預處理之后的沉積物樣品置于-80℃和65℃反復凍融三次，向樣品中加入溶菌酶，溶菌酶的終濃度為1mg/mL，在37℃水浴1h；向樣品中加入蛋白酶K和十二烷基磺酸鈉，蛋白酶K的終濃度為0.2mg/mL，十二烷基磺酸鈉的終濃度為1％，在55℃水浴1.5h，每10～15min輕輕倒置離心管幾次，混勻；樣品在室溫下10000rpm離心5min，取出500μL上清液置于一新離心管中，向其中加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇混合液，酚∶氯仿∶異戊醇的體積比為25∶24∶1，輕輕振蕩、混勻；室溫下14000rpm離心25min，取出400μL水相置于一新離心管中，加入等體積的氯仿∶異戊醇混合液，氯仿∶異戊醇的體積比為24∶1；室溫下14000rpm離心25min，取出300μL水相置于一新離心管中，加入200μL預冷的異丙醇，在-20℃沉淀2h；在4℃條件下，14000rpm離心25min，去上清，向沉淀中加入1mL?70％濃度的冷乙醇洗滌沉淀，12000rpm離心10min，去乙醇，再用同樣方法洗滌沉淀兩次；倒掉乙醇，在空氣中自然風干，用50μLTE緩沖液溶解DNA，保存于-20℃，所述TE緩沖液配方為10mM?Tris-HCl，1mMEDTA，pH8.0。?