[發(fā)明專(zhuān)利]一種區(qū)分單鏈和雙鏈核苷酸的熒光檢測(cè)方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910180448.5
• 申請(qǐng)日: 2009-10-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101659997A
• 公開(kāi)（公告）日: 2010-03-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳友強(qiáng);陳利祥;張新霓
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 青島大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種區(qū)分單鏈(ssDNA)和雙鏈核苷酸(dsDNA)的熒光檢測(cè)方法，屬材料制備技 術(shù)領(lǐng)域。

技術(shù)背景

在生物傳感體系的研究中，DNA、蛋白質(zhì)、酶、生物小分子的檢測(cè)和分析是非常重要的 研究?jī)?nèi)容。其中DNA和RNA的定量分析和特異性識(shí)別在基因組學(xué)、病毒學(xué)、分子生物學(xué)、 疾病診斷、基因突變和基因傳遞等領(lǐng)域具有十分重要的意義。然而，在對(duì)DNA進(jìn)行快速、 靈敏、低成本的檢測(cè)、與識(shí)別上仍然存在較大困難和挑戰(zhàn)，而這些技術(shù)正是DNA檢測(cè)分析 在實(shí)際應(yīng)用中的關(guān)鍵一環(huán)。

近年的國(guó)內(nèi)外研究工作已證明，在檢測(cè)痕量的化學(xué)和生物目標(biāo)分子時(shí)，熒光共軛聚合物 的靈敏度要遠(yuǎn)高于相應(yīng)的熒光小分子。它的這一性質(zhì)來(lái)自于其特有的、沿著共軛骨架離域的π 電子所產(chǎn)生的異常強(qiáng)的分子鏈內(nèi)和分子鏈間的能量轉(zhuǎn)移以及相對(duì)較強(qiáng)的光捕獲能力。方法之 一是通過(guò)測(cè)量傳感體系的熒光超淬滅信號(hào)，來(lái)檢測(cè)出水溶液中低濃度的DNA目標(biāo)分子。但 這類(lèi)傳感體系大都需昂貴的熒光標(biāo)記的DNA探針且聚合物的聚合單元共軛體系小，不利于 分子鏈間的π電子相互作用的產(chǎn)生。目前已知文獻(xiàn)中，還未見(jiàn)利用含稠環(huán)結(jié)構(gòu)聚合物通過(guò)傳感 體系的熒光恢復(fù)來(lái)檢測(cè)與區(qū)分單鏈(ssDNA)和雙鏈核苷酸(dsDNA)的報(bào)道。

本發(fā)明采用水溶性的寡聚芘的衍生物作為熒光探針，通過(guò)傳感體系的熒光恢復(fù)，直接有 效檢測(cè)與區(qū)分了水介質(zhì)中ssDNA和dsDNA，免除了因使用昂貴的帶有熒光標(biāo)記的DNA探針 而導(dǎo)致檢測(cè)成本上升等問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種區(qū)分ssDNA和dsDNA的新方法。本發(fā)明的方法 的制備過(guò)程簡(jiǎn)單可控，并具有很好的可重復(fù)性。最大的優(yōu)點(diǎn)在可直接有效檢測(cè)與區(qū)分了水介 質(zhì)中ssDNA和dsDNA，免除因使用昂貴的帶有熒光標(biāo)記的DNA探針而導(dǎo)致檢測(cè)成本上升等 問(wèn)題。

本發(fā)明所合成的寡聚物熒光探針?lè)肿拥幕瘜W(xué)結(jié)構(gòu)式為：

寡聚物名稱(chēng)：寡聚(N¹，N¹，N¹，N⁴，N⁴，N⁴-六甲基-2-(芘基-1-甲酰氧基)丁基-1，4-二甲基溴化胺 合成路線如下：

??????????????化合物1???????化合物2???????化合物3???????化合物4

本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為：區(qū)分ssDNA和dsDNA的熒光檢測(cè)的方 法包括以下具體步驟：

1)化合物1的合成：在50mL的圓底燒瓶中加入芘甲酸(200mg，0.813mmol)及20mL 二氯甲烷，并加入一滴N，N二甲基甲酰胺作為催化劑。混合溶液用冰水浴冷卻。

然后，在10min內(nèi)逐步滴加入0.21mL草酰氯(2.44mmol)。反應(yīng)8h后 經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑。之后加入50mL甲苯后，再經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后得到淡琥珀色的粗產(chǎn) 品。將該產(chǎn)物用甲苯和正己烷的混合溶劑(v/v＝1/1)于-20℃下重結(jié)晶純化24h， 最后得到白色的晶體，產(chǎn)率97％(242mg)，熔點(diǎn)：88-90℃；

2)化合物2的合成：將碳酸鉀(88mg，0.813mmol)和芘甲酰氯(200mg，0.813mmol) 溶解在5mL二氯甲烷中并加入一滴N，N-二甲基甲酰胺作為催化劑。然后，在5分 鐘內(nèi)逐步滴加0.2mL?1，4-二溴-2-丁醇(0.39mL，1.19mmol)。混合溶液用冰水浴 控制反應(yīng)溫度在0℃。待反應(yīng)冷卻后，濃縮混合溶液，然后用3×40mL?5％碳酸鉀水 溶液(重量比)和3×40mL水溶液反復(fù)洗滌三次，并放入真空烘箱中干燥。該粗產(chǎn)物 以氯仿為洗脫劑采用硅膠柱進(jìn)行純化，得到淺黃色粘性油狀物303mg，產(chǎn)率：95％；