[發(fā)明專利]日本囊對蝦線粒體cytb基因片段PCR擴(kuò)增引物及鑒別方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910179697.2
• 申請日: 2009-10-20
• 公開（公告）號: CN101693919A
• 公開（公告）日: 2010-04-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 徐田軍;王日昕;孟繁星;石戈
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江海洋學(xué)院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 杭州杭誠專利事務(wù)所有限公司 33109
• 代理人: 尉偉敏

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種用于重要蝦類種群識別的標(biāo)記，具體涉及用線粒體DNA分子標(biāo)記來鑒別日本囊對蝦福建群體與其他3個地理群體。

背景技術(shù)

日本囊對蝦(Marsupenaeus?japonicus)屬于對蝦科，囊對蝦屬，廣泛分布于日本沿海、我國東南沿海及東南亞沿海等海域。在我國對蝦養(yǎng)殖品種中，日本囊對蝦能適應(yīng)低溶解氧而具有適宜長途活運(yùn)的能力，并且經(jīng)濟(jì)價值在對蝦品種中位于榜首，是我國東南沿海重要的對蝦增養(yǎng)殖品種之一，主要分布海域包括浙江、福建、廣東及臺灣等省份。隨著海洋資源的日益枯竭及日本囊對蝦近親繁殖苗種的大量推廣，日本囊對蝦出現(xiàn)了養(yǎng)殖周期變長，生長速度減慢及抗逆性衰退等問題。水產(chǎn)品種可持續(xù)健康發(fā)展的最重要的因素是保證苗種的質(zhì)量，如何對現(xiàn)有的各重要海域的日本囊對蝦苗種進(jìn)行可靠科學(xué)的遺傳評估，分析其遺傳背景及育種潛力就變得非常重要。準(zhǔn)確的評價各海域日本囊對蝦群體的遺傳多樣性指標(biāo)及遺傳分化信息，可以為種質(zhì)資源保護(hù)，優(yōu)良親本的篩選、家系選育、分子標(biāo)記輔助育種及增養(yǎng)殖方案的正確制定提供科學(xué)理論依據(jù)。

根據(jù)中國發(fā)明專利CN200610031791.X中的內(nèi)容介紹，目前常用的DNA分子標(biāo)記技術(shù)主要有5種。其中動物線粒體DNA(mtDNA)由于具有絕大多數(shù)母系遺傳、進(jìn)化速度快、結(jié)構(gòu)簡單等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于研究動物的系統(tǒng)進(jìn)化、遺傳結(jié)構(gòu)調(diào)查、種群鑒別以及系譜發(fā)生分析。

目前的文獻(xiàn)報道主要關(guān)注的是對日本囊對蝦DNA序列的分析，比如欒生等發(fā)表的“日本囊對蝦基因組小衛(wèi)星的特征分析”[J]，水產(chǎn)學(xué)報，2007，31(2)：138-143；鄭連明等發(fā)表的“日本囊對蝦線粒體DNA?COI基因片段序列分析”[J]，廈門大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2005，44(6)：821-826。

發(fā)明人大量研究的結(jié)果表明，日本囊對蝦的福建群體具有較高的遺傳多樣性指數(shù)，具有較好的育種潛能，可以利用福建群體的個體進(jìn)行良種選育，但是從表觀上是很難看出群體之間區(qū)別的，因此就需要一種穩(wěn)定可靠的鑒別方法來從育種的親本中準(zhǔn)確地篩選出福建群體的日本囊對蝦。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)缺乏有效篩選日本囊對蝦福建群體的不足，從PCR擴(kuò)增引物角度出發(fā)，發(fā)明人首先提供一對保守引物；另一個發(fā)明目的是提供利用所述的一對保守引物，通過PCR擴(kuò)增技術(shù)來實(shí)現(xiàn)對日本囊對蝦地理群體的鑒別，進(jìn)一步可從育種的親本中準(zhǔn)確地篩選出福建群體的日本囊對蝦。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，發(fā)明人提供以下技術(shù)方案：

發(fā)明人首先是提供了一對日本囊對蝦線粒體cytb基因片段PCR擴(kuò)增引物，這對引物是根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)公布的日本囊對蝦的線粒體基因組全序列設(shè)計的，分別具有SEQ?No.1或SEQ?No.2所示的核苷酸序列：

L10945(SEQ?No.1)：5’-TGAGGAGGTTTCGCAGTA-3’、

H11563(SEQ?No.2)：5’-AGATGAGGGTGAGTGGGT-3’。

利用上述的一對日本囊對蝦線粒體cytb基因片段PCR擴(kuò)增引物，可實(shí)現(xiàn)對日本囊對蝦地理群體的鑒別，從而鑒別選出日本囊對蝦福建群體。具體來說，所述的日本囊對蝦福建群體的鑒別方法包括下述步驟：

(1)利用上述的一對擴(kuò)增引物對日本囊對蝦待測樣品的線粒體DNA中細(xì)胞色素b基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

(2)擴(kuò)增產(chǎn)物純化后測序，其中，核苷酸序列第528位和第534位堿基為G的待測樣品來自福建群體。

作為優(yōu)選，本發(fā)明所述的鑒別方法中，所述步驟(1)中的日本囊對蝦待測樣品選自廣東群體、臺灣群體、浙江群體和福建群體。

作為優(yōu)選，本發(fā)明所述的鑒別方法中，所述步驟(1)中PCR擴(kuò)增的條件為：94℃預(yù)變性4min，94℃變性30sec，50℃退火45sec，72℃延伸45sec；經(jīng)30個循環(huán)后再在72℃延伸7min。

作為優(yōu)選，本發(fā)明所述的鑒別方法中，所述步驟(1)中PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系組成為：

0.2ml?PCR薄壁管中加入以下組分：10×Buffer?5μL，dNTP各0.2mmol/L，L10945、H11563引物各0.2μmol/L，Taq?plus?DNA聚合酶2U，DNA模板50-100ng，最后用滅菌的雙蒸水補(bǔ)至50μL。

作為優(yōu)選，本發(fā)明所述的鑒別方法中，所述步驟(2)中的擴(kuò)增產(chǎn)物純化采用膠回收試劑盒。所述的膠回收試劑盒為本領(lǐng)域通用產(chǎn)品，比如采用OMEGA公司生產(chǎn)的膠回收試劑盒。