[發明專利]益生菌乳制品中羅伊氏乳桿菌的快速定性、定量測定方法

有效

• 申請號: 200910177907.4
• 申請日: 2009-09-21
• 公開（公告）號: CN101649353A
• 公開（公告）日: 2010-02-17
• 發明（設計）人: 張和平;張家超;包秋華
• 申請（專利權）人: 內蒙古農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64;C12R1/225
• 代理公司: 北京君智知識產權代理事務所
• 代理人: 向 華

【技術領域】

本發明涉及含有益生菌的乳制品技術領域。更具體地，本發明涉及一 種在益生菌乳制品中羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus?reuteri)的快速定性、 定量測定方法。

【背景技術】

益生乳制品因其豐富的營養價值和特殊的益生功效成為人們關注的 熱點。目前市場上益生菌及含有益生菌的乳制品種類繁多，并且每年以高 速度增長。對其質量的監管和認證，尤其在定性、定量檢測方面缺乏科學、 合理、快速的方法。傳統方法中對益生菌的定性、定量檢測，仍采用生理 生化反應和選擇性培養基純培養分離計數的方法。傳統方法易受培養條 件、菌種特性等因素影響，檢測效率有限，而且受外界環境因素和培養基 性能的影響大，檢測結果缺乏穩定性和可靠性，且耗時耗力。PCR技術一 經出現就被廣泛應用于分子生物學和微生物學等領域。實時熒光定量PCR (Real-time?PCR)的出現更是實現了PCR技術從定性到定量的飛躍，避免 了傳統PCR定量鑒定中交叉污染的問題。具有特異性強、重復性好、準 確、快速等優點，成為了分子生物學和微生物學領域定量檢測的重要方法。 采用乳桿菌種屬特異性PCR和實時熒光定量PCR技術，建立簡便、快速、 準確的益生菌乳制品中羅伊氏乳桿菌的定性、定量測定方法，可以簡化益 生菌的檢測程序、提高檢測效率，能提高我國益生菌的檢測能力，完善保 健食品的質量監管，并為益生菌產業的長遠發展提供技術保障。

本發明針對益生菌乳制品中含有的羅伊氏乳桿菌，依據參考文獻自行 設計羅伊氏乳桿菌的16S?rRNA基因序列的種屬特異性引物，應用此引物 進行種屬特異性PCR和實時熒光定量PCR反應，通過瓊脂糖凝膠電泳圖 譜分析和實時熒光定量PCR圖譜分析，建立益生菌乳制品中羅伊氏乳桿 菌的簡便、快速、準確的定性和定量測定方法。

【發明內容】

[要解決的技術問題]

本發明的目的是提供一種益生菌乳制品中羅伊氏乳桿菌的快速定性 方法。

本發明的另一個目的是提供一種益生菌乳制品中羅伊氏乳桿菌的快 速定量方法。

[技術方案]

本發明是通過下述技術方案實現的。

本發明涉及一種益生菌乳制品中羅伊氏乳桿菌的快速定性測定方法。 該方法的步驟如下：

A、模板DNA的制備

(1)取益生菌發酵乳樣品于2.0mL離心管中，加入500μLTE緩沖 液，混合均勻，再置于液氮中進行凍結，凍結后取出放入65℃水浴中進行 融化4-6min，如此反復進行凍融3-5次；

(2)凍融結束后，往其中加入60.0μL10％(質量體積比)的SDS和 10.0μL10mg/mL蛋白酶K，在搖床中在溫度37℃下以200r/min進行搖動 4h；

(3)加入100.0μL5M?NaCl和100μL?CTAB/NaCl溶液(將4.1gNaCl 溶于80ml水中，再緩慢加入10g?CTAB得到的溶液)，65℃水浴10min。

(4)然后，加入與在步驟(3)得到的溶液等體積的苯酚、氯仿和異 戊醇混合物，它們的體積比分別是25∶24∶1，混勻，再以10000g/min離 心10min，該溶液分成上層水相、中間固相與下層有機相；

(5)吸取上層水相，加入與所述水相等體積的上述苯氯仿和異戊醇 混合物抽提一次，分離上清液；

(6)往所述的上清液中加入0.1倍體積的3mol/L醋酸鈉和1倍體積 的冰異丙醇，混合均勻靜置30min，以10000g/min離心5min得到總DNA 沉淀；

(7)所述沉淀用70體積比％乙醇水溶液洗滌2次，再在室溫下自然 干燥，得到模板DNA；然后加入50.0μL無菌超純水回溶，在溫度-20℃下 保存備用。

B、PCR擴增

反應體系25.0μL：2.5μL10×PCR?Buffer、1.0μL25mmol/L?Mg²⁺、2μL 2.5mmol/L?dNTPs、2.5μL?5mmol/L上下游引物、1.0μL?50ng/μL?DNA模板， 0.25uL?5U/μL?Taq酶，二次蒸餾水補足至25.0μL；

PCR反應條件：95℃預變性3min；95℃變性40S，56℃退火30S，72℃ 延伸1min，循環40次；72℃延伸8min，得到PCR擴增產物，在溫度4℃ 下保存；