[發明專利]益生菌乳制品中羅伊氏乳桿菌的快速定性、定量測定方法

有效

• 申請號: 200910177907.4
• 申請日: 2009-09-21
• 公開（公告）號: CN101649353A
• 公開（公告）日: 2010-02-17
• 發明（設計）人: 張和平;張家超;包秋華
• 申請（專利權）人: 內蒙古農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64;C12R1/225
• 代理公司: 北京君智知識產權代理事務所
• 代理人: 向 華

1.一種益生菌乳制品中羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)的定性測 定方法，其特征在于該方法的步驟如下：

A、模板DNA的制備

（1）取益生菌發酵乳樣品于2.0mL離心管中，加入500.0μL?TE緩沖 液，混合均勻，再置于液氮中進行完全凍結，凍結后取出放入65℃水浴中 進行融化4-6min，如此反復進行凍融3-5次；

（2）凍融結束后，往其中加入60.0μL以質量體積比計10%SDS和 10.0μL10mg/mL蛋白酶K，在搖床中在溫度37℃下以200r/min進行搖動 4h；

（3）加入100.0μL5M?NaCl和100.0μL10%CTAB/NaCl溶液，65℃ 水浴10min；所述CTAB/NaCl溶液是將4.1gNaCl溶于80ml水中，再緩慢 加入10g?CTAB得到的溶液；

（4）加入與在步驟（3）得到的溶液等體積的苯酚、氯仿和異戊醇混 合物，它們的體積比分別是25：24：1，混勻，再以10000g離心10min， 該溶液分成上層水相、中間固相與下層有機相；

（5）吸取上層水相，加入與所述水相等體積的上述苯酚、氯仿和異 戊醇混合物抽提一次，分離上清液；

（6）往所述的上清液中加入0.1倍體積的3mol/L醋酸鈉和1倍體積 的冰異丙醇，混合均勻，再靜置30min，以10000g離心5min，得到總DNA 沉淀；

（7）所述沉淀用體積比70%乙醇水溶液洗滌2次，再在室溫下自然 干燥，得到模板DNA；然后加入50.0μL無菌超純水回溶，在溫度-20℃下 保存備用;

B、PCR擴增

反應體系25.0μL：2.5μL10×PCR?Buffer、1.0μL25mmo1/L?Mg²⁺、2.0μL 2.5mmol/L?dNTPs、2.5μL5mmol/L上下游引物、1.0μL50ng/μLDNA模板， 0.25μL5U/μL?Taq酶，ddH₂O補足至25.0μL；

上下游引物分別是：

上游引物REf為5’-GATTGACGATGGATCACCAG-3’；

下游引物REr為5’-ACTACCAGGGTATCTAATCC-3’，擴增片斷長 度為740bp；

PCR反應條件：95℃預變性3min；95℃變性40S，56℃退火30S，72℃ 延伸1min，循環40次；72℃延伸8min，得到PCR擴增產物，在溫度4℃ 下保存；

取3.0μLPCR產物使用1%瓊脂糖凝膠進行檢測;

C、結果及判斷

檢測時設以含有目的擴增片斷的質粒DNA作為模板為陽性對照，以 滅菌水作為模板為陰性對照；根據在740bp處出現預期特征條帶，確定該 益生菌乳制品中含有羅伊氏乳桿菌，相反地則不含有羅伊氏乳桿菌。