[發明專利]一種KRAS基因和/或BRAF基因的核苷酸突變位點的檢測方法

有效

• 申請號: 200910177851.2
• 申請日: 2009-09-28
• 公開（公告）號: CN101838683A
• 公開（公告）日: 2010-09-22
• 發明（設計）人: 韋清;王威;高揚;李晶晶;吳平;王麗萍;呂芳;易鑫;喻爽;聶喜芳;李國宏;易吉;朱江陽;劉興旺;張俊青;朱德琴;張秀芝;田超;葉葭;華桑;楊玲
• 申請（專利權）人: 深圳華大基因科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N27/64;C12N15/11
• 代理公司: 北京北翔知識產權代理有限公司 11285
• 代理人: 張廣育;姜建成

技術領域

本發明屬于基因組學和分子生物學中有機生物分子領域，具體而言涉及KRAS基因和/或BRAF基因的核苷酸突變位點的檢測方法。

背景技術

自然界大多數生物體的遺傳信息均包含在脫氧核糖核酸(DNA)中，人類全基因組中30億個堿基，約4萬個基因，分布在24對染色體上。每個基因通過轉錄、翻譯，編碼特異的蛋白質，調控生物體內特定的生化反應，發揮特異的生物學功能。DNA序列的改變，即基因突變，會導致蛋白質結構、功能的改變或缺失，進而引起相關的遺傳疾病。基因突變包括DNA分子中發生堿基對的插入、缺失和改變(點突變)。

研究表明許多疾病的發生，如血友病、地中海貧血、杜氏型肌營養不良、亨廷頓舞蹈癥、老年癡呆癥、糖尿病、肥胖癥、心血管疾病以及自身免疫等3000多個疾病與基因突變密切相關。另外，近年來人們逐漸認識到癌癥的發生發展也是基因累積突變的結果。

在人類基因組中，約90％的差異是以單個核苷酸的差異體現出來的，主要由單個堿基的轉換(transition)或顛換(transversion)所引起，這樣的差異位點稱作單核苷酸多態性(single?nucleotide?polymorphism，SNP)。在人群中，這種變異的發生頻率至少要大于1％，否則被認為是點突變。SNP位點大多數為雙態，即在一個位點上僅有兩種表現形式，并且在人類基因組中廣泛存在，平均每500-1000個堿基對中就有1個，估計其總數可達300萬個甚至更多。這些差異極有可能是造成個體差異的遺傳因素，因此發現這些位點可廣泛地應用于遺傳標記的研究、評估個體遺傳關系、評估物種進化等研究領域。

目前檢測SNP和基因突變的方法有許多種，如直接PCR測序、RFLP、基因芯片和熒光定量PCR等。其中，直接PCR測序最不敏感，只有耐藥突變株達到20％以上才能被檢測到；也不適用于大規模篩選；RFLP分析只能檢測出在病毒總體中大于5％的突變株，但是對于每個感興趣的突變，必須特別設計單獨的核酸內切酶。針對某些突變的特異性內切酶可能并不存在，因此RFLP分析并不適用于所有的突變。基因芯片技術利用寡核苷酸微點陣，可以檢測新發現的突變，但這種方法代價昂貴，沒有得到廣泛應用。總之，上述這些方法不是費時費力，靈敏度低，準確度低，就是成本高，不適合大規模篩查。

KRAS基因與BRAF基因

KRAS基因突變檢測做為結直腸癌患者進入個體化靶向治療療程之前需要進行的檢測，已經被NCCN(美國癌癥綜合網絡)列為《結腸癌臨床治療指南》中必不可少的一項，用于輔助臨床醫生篩選出可受益于Cetuximab(愛必妥)和Panitumumab(帕尼單抗)等特效藥的結直腸癌患者。研究表明腫瘤組織中KRAS基因突變主要發生在編碼子12和13(位于第2外顯子)位置上，發生頻率約為25.4％，9.2％，此外，少部分突變發生在編碼子61和146位置上，發生頻率約為0.4％和1.3％。未發生突變(體細胞突變)的病人，服用有關靶向治療藥物，能獲得明顯治療效果，而突變患者對此類靶向藥物耐藥。

BRAF基因做為MAPK通路中的一個重要環節，其突變類型主要為V600E，其突變可誘導細胞增殖，阻止細胞凋亡；野生型BRAF基因的存在是結直腸癌患者使用愛必妥和帕尼單抗有效的一個重要條件。

因此對上述突變位點的耐藥性突變的檢測具有重要的臨床意義。

KRAS基因與BRAF基因的核苷酸突變位點的檢測

目前對于KRAS基因和BRAF基因的突變檢測運用的方法主要有熒光定量PCR的方法、直接測序的方法及質譜檢測法。

熒光定量PCR主要針對BRAF基因V600E、KRAS基因12、13位密碼子的7種突變類型進行檢測，通過檢測結果的熒光信號來判斷所述位點有無突變。熒光定量PCR最常用的探針類型為Taqman探針，常用的熒光基團有FAM、TET和VIC等，在探針完整時，由于熒光猝滅基團在吸收報告基團所發射的熒光能量時本身會發射波長不同的熒光導致背景較高。

直接測序的方法主要通過測序獲得含有突變位點的全長序列。目前主要針對KRAS基因12、13和61位密碼子進行，該方法缺點是需要待檢樣本中突變型的含量達到較高比例，一般需要突變樣本的含量占全部樣本量的20-30％才能有較好的檢測效果。

不論是熒光定量還是直接測序，均存在靈敏度不高的問題。文獻報道熒光定量PCR的檢出限約為5％左右(即突變型的比例占總樣本比例的5％)，基于測序的檢測方法的檢出限僅為20％左右。與之相比，質譜技術能夠檢測到低至1％比例的突變，靈敏度較高。