[發明專利]一種KRAS基因和/或BRAF基因的核苷酸突變位點的檢測方法

有效

• 申請號: 200910177851.2
• 申請日: 2009-09-28
• 公開（公告）號: CN101838683A
• 公開（公告）日: 2010-09-22
• 發明（設計）人: 韋清;王威;高揚;李晶晶;吳平;王麗萍;呂芳;易鑫;喻爽;聶喜芳;李國宏;易吉;朱江陽;劉興旺;張俊青;朱德琴;張秀芝;田超;葉葭;華桑;楊玲
• 申請（專利權）人: 深圳華大基因科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N27/64;C12N15/11
• 代理公司: 北京北翔知識產權代理有限公司 11285
• 代理人: 張廣育;姜建成

1.一種核苷酸突變位點的檢測方法，包括如下步驟：

(1)針對待檢核苷酸序列的突變位點，確定突變位點在待檢序列中的位置；

(2)根據突變位點的位置和基因型設計擴增引物對和至少一條延伸引物，其中，擴增引物的長度至少30bp，其5’端各含10bp的tag；延伸引物的長度為17-28bp，并且其3’末端堿基與突變位點3’端相鄰的堿基完全匹配；

(3)使用所述擴增引物對進行PCR擴增，獲得含有所述突變位點的靶序列擴增產物；

(4)通過SAP酶處理，除去所述擴增產物中含有的dNTPs；

(5)使用所述延伸引物進行延伸反應，在延伸引物的3’端連接一個堿基，且該堿基與突變位點上的堿基互補，延伸反應所使用的原料是以擴大分子量差異為目的進行過質量修飾的四種ddNTP分子；

(6)采用樹脂純化延伸反應產物；

(7)將純化后的產物與芯片基質共結晶，將該晶體放入質譜儀的真空管，然后用瞬時納秒強激光激發進行質譜檢測，確定突變的基因型；

其中所述步驟(2)所使用的擴增引物對為具有SEQ?ID?NO：1和SEQ?IDNO：2所示序列的多核苷酸的組合；

并且其中所述步驟(5)所使用的延伸引物包括具有SEQ?ID?NO：9至SEQ?ID?NO：12任一項所示序列的多核苷酸的一種或多種。

2.如權利要求1所述的方法，其中所述步驟(2)所使用的擴增引物對還包括一對或多對具有SEQ?ID?NO：3和SEQ?ID?NO：4，SEQ?ID?NO：5和SEQ?ID?NO：6所示序列的多核苷酸的組合。

3.如權利要求2所述的方法，其中所述步驟(5)中所使用的延伸引物還包括具有SEQ?ID?NO：13至SEQ?ID?NO：18所示序列的多核苷酸。

4.如權利要求1所述的方法，其中所述步驟(2)所使用的擴增引物對還包括具有SEQ?ID?NO：7和SEQ?ID?NO：8所示序列的多核苷酸的組合。

5.如權利要求4所述的方法，其中所述步驟(5)中所使用的延伸引物還包括具有SEQ?ID?NO：19所示序列的多核苷酸。

6.如權利要求1所述的方法，其中所述核苷酸突變位點為KRAS基因的第12、13、61和146密碼子和BRAF基因的第600位密碼子中的一種或幾種。

7.一種多核苷酸，具有SEQ?ID?NO：1至SEQ?ID?NO：19任一項所示的核苷酸序列。

8.用于KRAS基因和/或BRAF基因的核苷酸突變位點的檢測方法中的引物組合，包括選自具有SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2，SEQ?ID?NO：3和SEQ?ID?NO：4，SEQ?ID?NO：5和SEQ?ID?NO：6，或SEQ?ID?NO：7和SEQ?ID?NO：8所示序列的一對或多對多核苷酸作為擴增引物，以及選自具有SEQ?ID?NO：9至SEQ?ID?NO：19任一項所示序列的一種或多種多核苷酸作為延伸引物。

9.權利要求7所述的多核苷酸或權利要求8所述的引物組合用于檢測KRAS基因和/或BRAF基因的核苷酸突變位點的用途。