[發明專利]一種檢測牛型結核分枝桿菌抗體的免疫層析試紙及其制備方法

無效

• 申請號: 200910177452.6
• 申請日: 2009-09-29
• 公開（公告）號: CN101692089A
• 公開（公告）日: 2010-04-07
• 發明（設計）人: 端青;趙海;朱虹;何君;檀華;李巖偉
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/558;G01N33/532
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技術領域

本發明涉及一種牛型結核分枝桿菌抗體的檢測試紙及其制備方法，特別是涉及一種檢測牛型結核分枝桿菌抗體的免疫層析試紙及其制備方法。

背景技術

自從1882年Kock發現結核分枝桿菌以來，已報道的分枝桿菌有100多種。有關分枝桿菌的分類有很多，國際上通常將分枝桿菌分為典型結核分枝桿菌(tuberculosismycobacterium，TM)，和非結核分枝桿菌(non-tuberculosis?mycobacterium，NTM)。TM包括人型結核分枝桿菌、牛型結核分枝桿菌、非洲結核分枝桿菌和田鼠分枝桿菌，又稱為結核分枝桿菌復合群(mycobacterium?tuberculosis?complex，MTBC)，該群中DNA相關性約為85％～100％，分類地位相近；NTM指MTBC和麻風分枝桿菌以外的所有其它分枝桿菌。

結核是由MTBC中細菌引起的人畜共患傳染病，近年來全球發病率逐年上升，特別是近年來發現由牛結核分枝桿菌引起的人類結核已成為值得關注的公共衛生問題。研究表明，結核病牛可通過痰液、乳汁、糞便等向外排出結核桿菌污染環境，因此，動物檢疫是控制結核病的重要環節。

牛結核病抗體檢測的方法很多，例如：ELISA和免疫傳感器技術等。但在實踐中，這些方法的使用暴露出一些共同的劣勢，例如：實驗必須在專門的實驗室中進行；需要電源和特殊的儀器；操作人員必須經過專門培訓；實驗系統不容易標準化，不容易在基層推廣，為使結果可信，需要進行多次預試驗和設立多項對照；試驗操作步驟繁瑣，至少需要2小時以上。

表面脂蛋白83(cell?surface?lipoprotein?MPB83，MPB83)和主要分泌性免疫蛋白70(major?secreted?immunogenic?protein?mpb70，MPB70)是牛分枝桿菌主要的特異性分泌抗原，并可在其中高水平表達(如MPB70可占牛結核分枝桿菌培養濾液蛋白的10％)，而在人型結核分枝桿菌H37Rv株中僅有少量產生，至今尚未證明MPB83在結核分枝桿菌復合群以外的分枝桿菌中存在。因此，MPB83和MPB70具有顯著的種特異性。

MPB70編碼基因大小約583bp，蛋白分子量約為22KDa，是感染動物體內T細胞識別的一種血清優勢抗原，BCG接種牛的T細胞不識別MPB70。MPB83編碼基因大小約603bp，蛋白分子量約為30KDa，是牛分枝桿菌的免疫主導蛋白，也是牛結核菌素的有效成分，能誘導很強的遲發型變態反應，刺激T淋巴細胞增殖和抗體產生。MPB70和MPB83的氨基酸序列具有61％的同源性，單克隆抗體驗證了二者具有某些共同的抗原決定簇。但與MPB70不同的是，MPB83是牛分枝桿菌表面相關性脂蛋白，其基因片段中含有一段典型的脂蛋白序列，并且在N端插有5個獨特的氨基酸(Behr?MR.et?al.Mutations?inMycobacterium?tuberculosis?Rv0444c，the?gene?encoding?anti-SigK，explain?highlevel?expression?of?MPB70?and?MPB83?in?Mycobacterium?bovis[J].Mol?microbial2006，62(5)：1251-1263.)。

6Kda早期分泌性蛋白(6kDa?early?secretory?antigenic?target，ESXA)和10Kda培養濾液蛋白(10kDa?culture?filtrate?antigen，ESXB)是近幾年研究較多的兩種結核分枝桿菌蛋白抗原，是存在于致病性結核分枝桿菌培養濾液中的早期分泌蛋白，均由BCG缺失的基因片段(RD1)所編碼(Van?pinxteren，Laurens?A.H，et?al.Diagnosisof?Tuberculosis?Based?on?the?Two?Specifi?c?Antigens?ESAT-6and?ESXB[J].Clinicaland?diagnostic?laboratory?immunology，2000，7(2)：155-160)，序列有25％的同源性，誘導強烈的T淋巴細胞增殖活化和細胞因子分泌。

免疫膠體金技術是近年來迅速發展的快速檢測技術，該技術與其它方法比較，優勢在于：檢測過程中標本處理簡單，不需要專門儀器和人員培訓，非專業技術人員按照說明書即可操作，并可迅速觀察結果，很適合突發事件現場和基層使用。