[發(fā)明專利]微生物菌種的存活率及活性的檢測方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910174930.8
• 申請日: 2009-11-03
• 公開（公告）號: CN102051404A
• 公開（公告）日: 2011-05-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 袁飛;陳穎;徐寶梁;趙貴明;張菲菲;楊海榮;趙勇勝
• 申請（專利權(quán)）人: 中國檢驗檢疫科學(xué)研究院;袁飛
• 主分類號: C12Q1/06
• 分類號: C12Q1/06;C12R1/42;C12R1/01
• 代理公司: 隆天國際知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 72003
• 代理人: 吳小瑛;呂俊清

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種微生物菌種的存活率及活性的檢測方法，特別是涉及一種采用實時掃描微生物生長而快速測定菌種的存活率及活性的方法。

背景技術(shù)

微生物菌種的保存是一項非常重要的工作，在科研和檢測過程中有研究價值的微生物菌種都需要保存下來，并且還有很多專業(yè)機構(gòu)專門從事微生物菌種的保存工作。微生物菌種采用不同的保護劑，經(jīng)過不同的方式保存。保存起來后，每隔一段時間就需要對菌種進行抽樣，并測定抽取菌種的存活率及活性，然后根據(jù)存活率及活性情況確定是否可以繼續(xù)保存，或需要復(fù)壯后重新保存。該項測定工作，工作量大，并要求實驗重復(fù)性好。

微生物菌種存活率測定，即將微生物菌種復(fù)活后，進行計數(shù)；微生物菌種活性測定，通常是將菌種復(fù)活后，培養(yǎng)一段時間，定期取樣計數(shù)，測定其生長曲線。兩種測定都需要進行微生物計數(shù)，目前計數(shù)方法除了傳統(tǒng)的活菌染色顯微鏡計數(shù)、平板計數(shù)等方法外，還有濁度法和噻唑藍(MTT)法。前兩種傳統(tǒng)方法，耗時長，操作繁瑣，在大規(guī)模、重復(fù)性測定中更加顯得很不方便。濁度法，其原理是細菌生長，濁度增加。但是，由于濁度的分辨率較低，且不同微生物數(shù)量與濁度的關(guān)系也不同，因此常常發(fā)生以下兩個問題：一是，菌懸液濁度很低，但是實際菌懸液中微生物數(shù)量已經(jīng)大量增值；二是，雖然兩種菌濁度數(shù)值非常相近，但是實際菌懸液中兩種菌的數(shù)量相差3個數(shù)量級以上，從而造成濁度法計數(shù)微生物時出現(xiàn)濁度與微生物數(shù)量不一致情況，因此在大規(guī)模、重復(fù)性測定中一般使用得較少。

MTT法克服了濁度法的缺點，其原理是在微生物生長一段時間后，加入MTT和二甲基亞砜，終止反應(yīng)，產(chǎn)生藍色，測定520nm處吸收，其吸收值與微生物數(shù)量成正比。但，目前采用的MTT法均采用終點法檢測，且通過建立的標準曲線進行定量，實驗操作繁瑣，且無法實現(xiàn)快速的實時檢測。

因此，本領(lǐng)域需要一種更為簡便、快速的測定菌種存活率和活性的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種微生物菌種存活率及活性的檢測方法，應(yīng)用這種方法可快速、簡便地檢測菌種的存活率及活性，根據(jù)檢測結(jié)果，如果菌種存活率高、活性好，則該菌種可以繼續(xù)保存，如果菌種存活率低或活性低，則可以通過復(fù)壯措施提高其存活率和活性，重新保存。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種微生物菌種的存活率及活性的檢測方法，其包括如下步驟：

A.將微生物菌種溶解在含有噻唑藍的培養(yǎng)液中，并進行稀釋得到菌懸液；

B.將不同稀釋梯度的菌懸液加入到培養(yǎng)板的各孔中；和

C.實時掃描測定，根據(jù)掃描結(jié)果計算菌種的存活率、判斷菌種的活性。

由于只要有活菌存在，經(jīng)過培養(yǎng)就能使噻唑藍產(chǎn)生藍色物質(zhì)，因此可根據(jù)出現(xiàn)吸收峰的孔的情況，確定發(fā)生生長的最低3個稀釋度和發(fā)生生長的孔數(shù)，例如可通過參考大腸菌群最大可能數(shù)(MPN)檢索表，確定菌種中活菌數(shù)量。將得到的保存菌種中的活菌數(shù)量除以菌種原先的活菌數(shù)量，可計算得出存活率。

由于吸收值與菌種生長情況成正比，因此可根據(jù)實時掃描獲得的時間-吸收曲線形狀判斷微生物菌種生長活性。生長曲線可分為三種類型：陡峭型、中間型、平緩型。陡峭型，延滯期短，對數(shù)期幾乎呈直線上升，穩(wěn)定期維持在較高的吸收值，且持續(xù)時間長；中間型，延滯期長，對數(shù)期緩慢上升，穩(wěn)定期維持在較低的吸收值，且持續(xù)時間短，很快進入衰亡期；平緩型，整個曲線呈拋物線型或貼近X軸呈直線，一直維持較低的吸收值。活性好的菌種為陡峭型生長曲線；活性差的菌種為中間型或平緩型生長曲線。同一菌種不同稀釋度的各孔的生長曲線，延滯期長短有差別，但是此后對數(shù)期的生長斜率和穩(wěn)定期的吸收值基本一致，從而可以根據(jù)生長曲線的類型確定菌種的活性。

本方法計數(shù)的原理是在含有MTT的培養(yǎng)基中加入多個(如8個)梯度稀釋(如10倍梯度稀釋)的菌懸液，每個菌株重復(fù)數(shù)次(如3次)，培養(yǎng)24小時后，確定發(fā)生生長的最低幾個(如3個)稀釋度和發(fā)生生長的孔數(shù)(出現(xiàn)吸收峰的孔表示該稀釋度有生長)，參考大腸菌群最可能數(shù)(MPN)檢索表，確定菌種中活菌數(shù)量。將本方法得到的保存菌種中的活菌數(shù)量，除以菌種原先的活菌數(shù)量，可計算得出存活率。