[發明專利]卷煙煙氣體外微核檢測方法

無效

• 申請號: 200910172252.1
• 申請日: 2009-09-24
• 公開（公告）號: CN101671734A
• 公開（公告）日: 2010-03-17
• 發明（設計）人: 尚平平;李翔;聶聰;彭斌;趙樂;劉惠民;謝劍平
• 申請（專利權）人: 中國煙草總公司鄭州煙草研究院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 鄭州中民專利代理有限公司
• 代理人: 姜振東

技術領域

本發明涉及卷煙毒性檢測方法，尤其是一種卷煙煙氣冷凝物體外微核試驗方法。

背景技術

微核是細胞的染色體發生斷裂后，細胞進入下一次分裂時，染色體片段不能隨有絲分裂進入子細胞，而在細胞漿中形成直徑小于主核的1/3的，嗜色與主核一致，完全與主核分開的圓形或橢圓形微小核。微核測定是一種簡便快速的細胞遺傳學檢查方法，在診斷、預防肝癌、食管癌、肺癌等惡性腫瘤，評價藥物、放射線及吸煙等細胞毒性物質對人、動物及體外細胞損傷程度有重要意義。

1923年，Taylor?C.V.首次發現了微核，并闡述了微核的意義。隨后，各研究機構開始開展一系列微核試驗進行染色體完整性改變和染色體分離改變的研究。一般采用的實驗動物為大鼠和小鼠，但以小鼠居多。采用小鼠骨髓細胞微核試驗，小鼠染毒一定時間后，處死，取胸骨，隨后將骨髓擠于清潔載玻片上，推片、固定、染色及計數，求出1000個骨髓細胞產生的微核數。另有采用小鼠股骨骨髓進行微核試驗。

而我國微核試驗創建于20世紀70年代中期，目前許多國家和國際組織，已將其規定為新藥、食品添加劑、農藥、化妝品等毒理安全性評價的必做試驗。

1976年，maier?P.采用10種誘突變物質進行小鼠骨髓微核試驗及中國倉鼠成纖維細胞(Chinese?hamster?fibroblasts)體外微核試驗，是體內體外相結合綜合研究，這是首次進行的體外微核試驗。受試細胞包括外周血淋巴細胞、中國倉鼠肺細胞、中國倉鼠卵巢細胞、人宮頸癌細胞、肝癌細胞等。細胞培養到一定濃度時，加入受試物培養一段時間后，染色，計數產生微核的細胞數。

關于卷煙煙氣的微核試驗則起始與1988年，Balansky等人選用BDF1小鼠，雌雄各半，置于含600cm²的卷煙煙氣的14L玻璃艙內，暴露24h后，取小鼠骨髓，固定染色后，計數小鼠骨髓多染紅細胞內的微核數，并比較多染紅細胞與正染紅細胞的比率。隨后，國內卷煙煙氣的微核試驗一直采用體內試驗方法。而體內試驗需要大量的動物，并且收集骨髓細胞工作量大，動物福利要求高，耗資大。而體外微核試驗可以獲得與體內微核試驗結果的一致性，并且敏感性、特異性和準確性都與體內微核實驗相當，而且在獲得細胞微核率的基礎上，還可以分析微核的來源。

本案申請人也申請了一種名為《評價卷煙煙氣毒性的小鼠體內微核分析檢測方法》專利，其申請號為200810049452.3，是采用周圍血進行觀察的體內微核試驗，并且是以經消化道染毒的方式來考察卷煙煙氣的染色體完整性及染色體分離的改變，染毒方式與實際暴露卷煙煙氣途徑不一致，試驗過程復雜，并且受試物的濃度不易控制。

發明內容

本發明的目的正是針對上述現有技術中所存在的問題而專門研制的一種卷煙煙氣體外微核檢測方法，采用體外微核試驗，來進行卷煙煙氣對細胞染色體畸變的評價，可以降低實驗成本，縮短試驗時間，獲得更為豐富的實驗結果。

本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：卷煙煙氣體外微核檢測方法，其特征在于：選用中國倉鼠卵巢細胞進行體外微核試驗，通過細胞培養、卷煙煙氣冷凝物制備、細胞染毒、固定、染色后，測定細胞微核發生率。

其具體步驟如下：

1)細胞培養

中國倉鼠卵巢細胞復蘇之后，接種到25mL細胞培養瓶，在二氧化碳培養箱培養24h，待細胞繁殖到5.0×10⁵-1.0×10⁶個/瓶，消化細胞并傳至足夠的培養瓶中繼續培養，至細胞濃度達到所需濃度；

2)卷煙煙氣冷凝物制備

標準卷煙抽吸條件下，用二甲基亞砜DMSO萃取煙氣冷凝物CSC，用細胞培養基將卷煙煙氣冷凝物稀釋至不同劑量，保證至少有4個非0的濃度，并配制新鮮的S9(大鼠肝微粒體酶)混合液；

3)細胞染毒

傳代后的細胞培養24h后，吸出原有培養基，用磷酸鹽緩沖液沖洗1-2遍后，然后將不同劑量的CSC加入到培養瓶，每個劑量為2個培養瓶，需要活化的另加入S9混合液，繼續于二氧化碳培養箱培養27h；

4)吖啶橙染色

培養結束后，將用胰蛋白酶將貼壁生長的細胞脫離細胞瓶底，進行玻片涂片，用固定液(冰醋酸∶甲醇為1∶3)對細胞進行固定。然后用吖啶橙染劑染色5min，沖洗染色劑，晾干玻片；

5)微核計數及計算微核發生率

在顯微鏡下觀察微核，并計數，每個培養瓶細胞計數1000個含微核的細胞數，即每個劑量計數2000個細胞的微核發生率。