[發(fā)明專利]卷煙煙氣體外微核檢測方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910172252.1
• 申請(qǐng)日: 2009-09-24
• 公開（公告）號(hào): CN101671734A
• 公開（公告）日: 2010-03-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 尚平平;李翔;聶聰;彭斌;趙樂;劉惠民;謝劍平
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國煙草總公司鄭州煙草研究院
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 鄭州中民專利代理有限公司
• 代理人: 姜振東

1、一種卷煙煙氣體外微核檢測方法，其特征在于：選用中國倉鼠卵巢細(xì)胞進(jìn)行體外微核試驗(yàn)，通過細(xì)胞培養(yǎng)、卷煙煙氣冷凝物制備、細(xì)胞染毒、固定、染色后，測定微核發(fā)生率。

2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的卷煙煙氣體外微核檢測方法，其特征在于：其具體步驟如下：

1)細(xì)胞培養(yǎng)

中國倉鼠卵巢細(xì)胞復(fù)蘇之后，接種到25mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶，在二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，待細(xì)胞繁殖到5.0×10⁵-1.0×10⁶個(gè)/瓶，用胰蛋白酶將貼壁生長的細(xì)胞脫離細(xì)胞瓶底，并傳至足夠的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，至細(xì)胞濃度達(dá)到所需濃度；

2)卷煙煙氣冷凝物制備

標(biāo)準(zhǔn)卷煙抽吸條件下，用二甲基亞砜DMSO萃取煙氣冷凝物CSC，用細(xì)胞培養(yǎng)基將卷煙煙氣冷凝物稀釋至不同劑量，保證至少有4個(gè)非0的濃度，并配制新鮮的S9(大鼠肝微粒體酶)混合液；

3)細(xì)胞染毒

傳代后的細(xì)胞培養(yǎng)24h后，吸出原有培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液沖洗1-2遍后，然后將不同劑量的CSC加入到培養(yǎng)瓶，如需活化加入S9混合液，每個(gè)劑量為2個(gè)培養(yǎng)瓶，繼續(xù)于二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)27h；

4)吖啶橙染色

培養(yǎng)結(jié)束后，用胰蛋白酶將貼壁生長的細(xì)胞脫離細(xì)胞瓶底，然后進(jìn)行玻片涂片，用固定液(冰醋酸∶甲醇為1∶3)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定，然后用吖啶橙染劑染色5min，沖洗染色劑，晾干玻片；

5)微核計(jì)數(shù)及計(jì)算微核發(fā)生率

在顯微鏡下觀察微核，并計(jì)數(shù)，每個(gè)培養(yǎng)瓶細(xì)胞計(jì)數(shù)1000個(gè)含微核的細(xì)胞數(shù)，即每個(gè)劑量計(jì)數(shù)2000個(gè)細(xì)胞的微核發(fā)生率。