[發(fā)明專利]臍帶華通膠來源的間充質(zhì)干細(xì)胞在心力衰竭細(xì)胞移植治療中的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910170248.1
• 申請日: 2009-09-09
• 公開（公告）號: CN101690731A
• 公開（公告）日: 2010-04-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 高連如;張寧坤;陳宇;楊曄;丁青艾;朱智明;曹毅
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍海軍總醫(yī)院
• 主分類號: A61K35/12
• 分類號: A61K35/12;A61P9/04;C12N5/08
• 代理公司: 北京知本村知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 11039
• 代理人: 周自清

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物材料在醫(yī)療領(lǐng)域的用途，特別涉及以人臍帶華通膠為原料制備的間充質(zhì)干細(xì)胞，在制備因冠心病及擴(kuò)張性心肌病引起的心力衰竭細(xì)胞移植材料方面的應(yīng)用。?

背景技術(shù)

全球每年有約1700萬人死于心血管疾病。雖然隨著藥物治療、介入技術(shù)和外科手術(shù)水平的提高，急性心肌梗死的病死率明顯下降，但循證醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)，即使早期成功接受再血管化治療的急性心肌梗死患者中，仍有超過30％的患者發(fā)展為缺血性心力衰竭，甚至進(jìn)一步發(fā)展為終末期缺血性心力衰竭。終末期缺血性心力衰竭是指：①有心肌梗死史；②有嚴(yán)重心力衰竭臨床表現(xiàn)并反復(fù)住院；③強(qiáng)化內(nèi)科藥物治療無效；④無內(nèi)科介入及外科搭橋手術(shù)指征；⑤左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)小于40％。終末期缺血性心力衰竭年死亡率在60％以上。對終末期缺血性心力衰竭所能采取的治療手段僅有兩項：①心臟移植；②安裝心室輔助裝置。心臟移植因為手術(shù)耐受、供體、免疫排斥等原因不可能廣泛使用；安裝心室輔助裝置則僅適用于短期支持過渡期嚴(yán)重血液動力學(xué)障礙急性患者，不能長期維持應(yīng)用。因此，當(dāng)前國際醫(yī)學(xué)界尚無有效方法逆轉(zhuǎn)終末期缺血性心力衰竭患者的病情。?

除缺血性心臟病所致的心力衰竭，擴(kuò)張性心肌病是慢性心力衰竭又一常見原因，其中包括病因不清的特發(fā)性心肌病和繼發(fā)于心肌炎后的心肌病。擴(kuò)張性心肌病引起的慢性心力衰竭1年病死率約25-30％，心臟移植是唯一有效治療措施。由于受供體來源和技術(shù)的限制，全球心臟移植每年只有三千余例，中國僅數(shù)十例。?

當(dāng)代細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展給這些慢性心力衰竭患者帶來了新的希望。臨床研究發(fā)現(xiàn)，自體骨髓單個核細(xì)胞、自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，以及內(nèi)皮祖細(xì)胞、骨髓側(cè)群細(xì)胞等成體干細(xì)胞移植治療缺血性心力衰竭、陳舊性心肌梗死及心肌梗死后心衰，可以不同程度改善心臟收縮和舒張功能、阻止左室重構(gòu)、改善預(yù)后。?

然而，細(xì)胞療法在臨床應(yīng)用中遇到了來自種子細(xì)胞的重重障礙：應(yīng)用胚胎干細(xì)胞存在倫理、法律、免疫排斥及致腫瘤性等問題；應(yīng)用自體成體干細(xì)胞遇到更多問題，諸如①骨髂肌成肌細(xì)胞移植存在嚴(yán)重致心律失常性；②骨髓單個核細(xì)胞移植成分復(fù)雜，所含具有多向分化潛能的干細(xì)胞數(shù)量低，分化潛能有限；③造血干細(xì)胞CD34不能分化為心肌細(xì)胞表型；④CD133細(xì)胞移植可致冠脈支架再狹窄；⑤內(nèi)皮祖細(xì)胞改善心功能作用有限；⑥骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)材料來源受限，細(xì)胞增殖分化潛能隨年齡的增長而明顯下降，尤其是冠心病患者M(jìn)SCs增殖分化能力明顯低于同齡健康人，體外長時間擴(kuò)增降低體內(nèi)分化歸巢潛能；⑦與自體MSCs相比，臍血MSCs有諸多優(yōu)點，但臍血源MSCs分離效率低，限制了其廣泛應(yīng)用。總之，當(dāng)前尚無一種理想的種子細(xì)胞滿足對這些慢性心力衰竭患者實施細(xì)胞生物學(xué)治療的臨床需求，需要突破的技術(shù)瓶頸是解決多能干細(xì)胞的來源。?

本發(fā)明人的在先專利申請“200910157731.6臍帶華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法及其產(chǎn)品”為心力衰竭患者實施細(xì)胞生物學(xué)治療提供了新的物質(zhì)基礎(chǔ)。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，將臍帶華通膠來源的間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用于因冠心病及擴(kuò)張性心肌病引起的慢性心力衰竭患者，作為對其實施細(xì)胞移植治療的材料，用以改善以上這些慢性心力衰竭患者的生存質(zhì)量，降低死亡率；同時克服冠心病及老年患者自體干細(xì)胞分化增殖及旁/自分泌功能減低不能達(dá)到有效的生物學(xué)效應(yīng)的缺陷。?

本發(fā)明所稱“臍帶華通膠來源的間充質(zhì)干細(xì)胞”，英文名稱為“UmbilicalCord?Wharton’s?Jelly-Derived?MSCs，UW-MSCs”，是按以下方法制備的：?

取人新鮮臍帶，以等滲的平衡鹽溶液或無血清培養(yǎng)基洗去臍帶殘留血液，去除臍動脈、臍靜脈及臍帶外膜，剝離華通膠并剪切成小塊，再以等滲的平衡鹽溶液或無血清培養(yǎng)液沖洗后，浸泡于0.05～0.3％膠原酶溶液中，置于35～37.5℃溫箱中10～30小時，組織塊消化，液體呈粘稠狀，然后加入相當(dāng)于原液1～10倍量的含胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化，分裝于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿，置CO₂培養(yǎng)箱，待細(xì)胞貼壁后更換含胎牛血清的培養(yǎng)基溶液，以后每隔2～4天換液一次，細(xì)胞貼壁融合后傳代培養(yǎng)；傳代培養(yǎng)2～4代，即時使用或冷凍保存?zhèn)溆谩?

本發(fā)明所稱“臍帶華通膠來源的間充質(zhì)干細(xì)胞”在生物學(xué)表型鑒定中，具有?以下技術(shù)特征：①在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下粘附于塑料制培養(yǎng)器皿生長；②表達(dá)CD90、CD105、CD44；HLA-ABC；不表達(dá)CD45、CD34，HLA-DR；③體外可誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。?