[發明專利]一種抑制動脈粥樣硬化的天然抗氧化低密度脂蛋白抗體

無效

• 申請號: 200910165494.8
• 申請日: 2009-08-13
• 公開（公告）號: CN101654481A
• 公開（公告）日: 2010-02-24
• 發明（設計）人: 馮旭陽;徐瑞芬;王海昌
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第四軍醫大學
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;C12N15/06;C12P21/08;G01N33/577;G01N33/543;A61K39/395;A61P9/10
• 代理公司: 西安慈源有限責任專利事務所
• 代理人: 鮑燕平

技術領域

本發明屬于生物醫學技術領域，具體涉及一種可以抑制動脈粥樣硬化的天然屬性抗氧化低密度脂蛋白(oxLDL)免疫球蛋白M(IgM)亞類抗體。

背景技術

動脈粥樣硬化是一種慢性血管壁疾病，可以導致心肌梗死，心衰，外周血管性疾病及中風。多重危險因素在不同方面導致了動脈粥樣硬化的形成，內皮功能受損是動脈粥樣病變的起始環節，各種危險因素均可造成內皮損傷。內皮受損后，血漿低密度脂蛋白(LDL)通過受損的內皮侵潤進入動脈壁，氧化成為oxLDL，被巨噬細胞吞噬，成為泡沫細胞，逐漸形成動脈粥樣硬化斑塊，各種原因導致斑塊破裂，使局部血小板聚集，血管栓塞，形成心肌或者腦梗死。

在動脈粥樣硬化形成過程中，巨噬細胞吞噬oxLDL后形成泡沫細胞起了關鍵作用。動脈粥樣硬化是一個慢性炎癥性疾病，與血管壁的LDL水平升高明顯相關。高脂血癥時，血漿LDL浸潤進入動脈壁，通過氧化修飾成為oxLDL。oxLDL被巨噬細胞上的清道夫受體攝取，這種攝取無反饋性調節，導致大量膽固醇蓄積，形成泡沫細胞，從而產生強大的致動脈粥樣硬化作用。隨著損害的進展，這些充滿脂質的細胞許多發生凋亡，但是不能被充分的清除，導致在損傷部位凋亡細胞不正常的蓄積。在這種條件下，凋亡細胞有可能發生二次壞死，易變形成為進展的動脈粥樣硬化斑塊非蜂窩狀的的粥樣特性。平滑肌細胞增殖并且分泌厚的膠原帽可能會穩定這種損害，但是脆弱的斑塊區域最終被侵蝕或者破裂，導致斑塊破裂，血栓形成，梗死，缺血等臨床事件發生甚至死亡。

基于動脈粥樣硬化在血管疾病中的不良后果，動脈粥樣硬化的預防及治療被持續重視，從降低LDL水平角度，目前通過飲食性預防、調脂藥等方法治療。從斑塊破裂，血栓形成的角度，目前有抗栓藥治療。但是從減少巨噬細胞對oxLDL的攝取，目前還沒有成熟的方法，近幾年，關于天然抗體在該領域的研究逐年增多。

天然抗體通常定義為人或動物未經明顯感染或人工注射抗原而天然存在于體內的各種抗體。天然抗體的產生與食物、花粉或某些異物的刺激有關。以IgM亞類為主，可識別多個不同的抗原表位。在維持機體自身正常內環境的穩定、防止自身免疫病發生等方面具有重要的作用。大量研究表明天然抗體可以識別多種與動脈粥樣硬化相關的脂類或脂蛋白。天然抗體在動脈粥樣硬化形成中的作用，已經達成以下共識：天然IgM亞類抗體阻止了巨噬細胞和oxLDL結合，從而封閉了單核-巨噬細胞對oxLDL的攝取，因此，在體內阻止了泡沫細胞的形成，從而降低動脈粥樣硬化斑塊的形成。在動脈粥樣硬化的進程中，oxLDL的抗原決定簇誘導產生天然自身抗體，由此激活存在oxLDL的高膽固醇血癥小鼠的免疫反應，可改善動脈粥樣硬化。oxLDL不僅促炎癥和促動脈粥樣硬化，并且在氧化過程中產生的幾個新生表位是有很高的致免疫能力，并導致產生天然自身IgM抗體，抑制動脈粥樣硬化進展。

發明內容

本發明的目的之一是制備并鑒定小鼠天然屬性抗oxLDL?IgM亞類抗體，為研究oxLDL及其天然抗體在動脈粥樣硬化發生發展中的作用奠定基礎。

本發明的另一個目的是該天然抗體在預防和治療動脈粥樣硬化領域中的應用。

本發明的目的是通過下述方法實現的，一種抑制動脈粥樣硬化的天然屬性抗oxLDL?IgM亞類抗體，其特征在于通過雜交瘤細技術制備出天然屬性抗oxLDL?IgM亞類抗體3A6，該抗體的作用在于與oxLDL結合形成免疫復合物，封閉了巨噬細胞對oxLDL的吞噬，減少了小鼠巨噬細胞系RAW-264.7向泡沫細胞的轉化，對apoE(載脂蛋白E)基因敲除小鼠胸主動脈粥樣硬化斑塊形成有抑制作用，因此該抗體可以用于抑制小鼠動脈粥樣硬化斑塊的形成。該抗體的制備為研究動脈粥樣硬化的發生發展和治療提供了新的思路和方法。

所述抗體的制備步驟如下：

(1)抗原的制備：LDL的分離提取及oxLDL的制備：取空腹12小時的正常人血漿，通過密度梯度離心法獲得LDL。將制備好的LDL于4℃，PBS透析24h，去除EDTA，與硫酸銅(5μmol/L)在37℃下共同孵育4h或者16h。得到銅氧化的低密度脂蛋白(oxLDL)。