[發明專利]一種抑制動脈粥樣硬化的天然抗氧化低密度脂蛋白抗體

無效

• 申請號: 200910165494.8
• 申請日: 2009-08-13
• 公開（公告）號: CN101654481A
• 公開（公告）日: 2010-02-24
• 發明（設計）人: 馮旭陽;徐瑞芬;王海昌
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第四軍醫大學
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;C12N15/06;C12P21/08;G01N33/577;G01N33/543;A61K39/395;A61P9/10
• 代理公司: 西安慈源有限責任專利事務所
• 代理人: 鮑燕平

1、一種抑制動脈粥樣硬化的天然屬性抗氧化低密度脂蛋白抗體，其特征在于通過雜交瘤細胞技術制備出天然屬性抗氧化低密度脂蛋白(oxLDL)免疫球蛋白M(IgM)亞類抗體3A6，該抗體與oxLDL作用形成免疫復合物，從而減少巨噬細胞對oxLDL的吞噬。

2、按照權利要求1所述的抑制動脈粥樣硬化的天然屬性抗oxLDL抗體，其特征在于所述抗體的制備步驟如下：

a抗原的制備：正常人血漿，通過密度梯度離心法獲得LDL，將制備好的LDL與硫酸銅共同孵育，得到氧化的LDL(即oxLDL)；

b抗體的制備：

1)在無特殊病原體條件下飼養Babl/c小鼠，給予高膽固醇飲食4周；

2)分離脾細胞，其主要成分為B細胞；

3)B細胞與骨髓瘤細胞以化學方法融合，獲得雜交瘤細胞；

4)以純化的低密度脂蛋白(LDL)和oxLDL為抗原，對陽性雜交瘤細胞生長孔進行間接酶聯免疫吸附測定(ELISA)實驗，確定陽性克隆孔，利用有限稀釋法，篩選出所需克隆陽性細胞；

5)將獲得的克隆陽性細胞進行克隆擴增，得到產生單克隆抗體的細胞，獲得所需單克隆抗體。

3、按照權利要求2所述的抑制動脈粥樣硬化的天然屬性抗oxLDL抗體，其特征在于使用所述Babl/c小鼠生產抗體。Babl/c品系小鼠為雌性，4-6周齡。

4、按照權利要求1所述的抑制動脈粥樣硬化的天然屬性抗oxLDL抗體，其特征在于所述抗體的單克隆抗體亞類和效價鑒定：經4次克隆化獲得的100％陽性單克隆雜交瘤細胞培養上清作為待檢樣品，使用Sigma公司小鼠免疫球蛋白亞類夾心ELISA試劑盒檢測雜交瘤產生抗體的亞類和亞型；同上述方法以oxLDL包被微量酶標板，常規間接ELISA法測定單抗腹水效價，ABTS為顯色底物。

5、按照權利要求1所述的抑制動脈粥樣硬化的天然屬性抗oxLDL抗體，其特征在于所述抗體的間接ELISA實驗鑒定：將抗原LDL、氧化4小時oxLDL、氧化16小時oxLDL和兩者混合oxLDL?5μg/ml分別包被于96孔ELISA板4℃過夜；以PBS/0.2％Tween洗滌孔4次，然后以含1％BSA的PBS封閉30min；將腹水按照1：10數量級稀釋后加入ELISA板中，37℃水浴作用1小時，以PBS/0.2％Tween洗滌孔4次，加入1：1000稀釋的辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgM，37℃水浴作用1小時，PBS/0.2％Tween洗滌孔4次，加入ABTS顯色10-15min，最后于ELISA讀數儀中在410nm測定吸光度；含IgM的腹水按照McCarthy的方法以兩步法純化，即快速的陽離子交換層析捕獲和用陰離子交換色譜洗脫純化。

6、按照權利要求1所述的抑制動脈粥樣硬化的天然屬性抗oxLDL抗體，其特征在于所述天然抗氧化低密度脂蛋白抗體可作為在抑制動脈粥樣硬化研究和治療中的應用。