[發(fā)明專利]一種快速篩選高油脂含量微藻種質的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910164175.5
• 申請日: 2009-08-03
• 公開（公告）號: CN101624615A
• 公開（公告）日: 2010-01-13
• 發(fā)明（設計）人: 鄧曉東;張毅;費小雯
• 申請（專利權）人: 中國熱帶農業(yè)科學院熱帶生物技術研究所
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;C12R1/89
• 代理公司: 海口翔翔專利事務有限公司
• 代理人: 莫 臻

技術領域

本發(fā)明涉及可再生能源領域，具體是一種快速篩選高油脂含量微藻種質的方法，利用該方法可從自然水域(淡水或海水)快速高效分離篩選到所需人工培養(yǎng)條件的目標藻株，用于制備生物柴油的原料。

背景技術

隨著全球經濟一體化的不斷發(fā)展，世界能源形勢日趨緊張，并且為了順應可持續(xù)發(fā)展的需要及愈加嚴格的環(huán)保要求，尋找一種綠色的可持續(xù)發(fā)展的新能源，成為各國關注的問題。開發(fā)可再生、環(huán)保的新能源已成為各國普遍關注的焦點之一，其中利用微藻制備生物柴油更以其無可比擬的優(yōu)點成為生物柴油領域的熱點。利用藻類生物質生產液體燃料，對緩解人類面臨的糧食、能源、環(huán)境三大危機，有著巨大的潛力，同時對于減少生產生活中對石油的依賴、保證國家能源安全具有深遠意義。

以微藻為原料生產生物柴油具有其他生物無可比擬的優(yōu)勢：單細胞微藻光合作用效率高，生長周期短、生長速度快、單位生物量大，在生產中可利用發(fā)酵技術在光生物反應器中高密度、高速率培養(yǎng)、不與農作物爭肥爭地。

目前，微藻制備生物柴油的研究主要集中在兩個方面：一是對生物柴油生產工藝的研究；二是生物柴油的生產原料的研究。成本過高?一直是生物柴油產業(yè)化發(fā)展的瓶頸問題，最有效的解決方式是從降低原料成本入手，這成為從源頭上降低生物柴油產品成本的重中之重，篩選分離生長速度快、油脂含量高的優(yōu)質微藻種質能最大限度降低原料成本，增加生物柴油大規(guī)模產業(yè)化的可行性、最終達到為社會建設和人民生活服務的目的。

現有常用的微藻種質分離技術有：1)微吸管分離法，采用口徑極細的微吸管，將稀釋適度藻液水樣，置淺凹載玻片上，顯微鏡下鏡下用微吸管挑選要分離的藻體，認真仔細地吸出，放入另一淺凹載片上達到分離目的。此法操作技術要求較高，往往吸取一個細胞，要反復幾次才能成功，且只適于分離個體較大藻類。2)水滴分離法，用微吸管吸取稀釋適度藻液，滴若干滴到無菌載片上，顯微鏡下觀察，如一滴水中只有幾個所需同種藻類，即用吸管吸取該滴培養(yǎng)物培養(yǎng)。此法也要求顯微鏡下觀察操作，有一定操作難度，較適宜于分離已在培養(yǎng)液中占優(yōu)勢種類。使用環(huán)境、器具及培養(yǎng)液要求無菌。3)稀釋分離法，把含有需要分離的藻類而又混雜有其他生物的水樣，取其一定量，用培養(yǎng)液稀釋。通過稀釋到適宜程度的方法，達到把原混雜生物單個分離培養(yǎng)的目的。4)平板分離法，用接種環(huán)蘸取藻液在固體平板上劃線，藻細胞就會散布在瓊脂培養(yǎng)基的表面，經培養(yǎng)后，挑取單藻落。該方法較適合分離有有污染雜菌培養(yǎng)液的藻類。

目前，對高含油量微藻的篩選一般是以已經分離純化的藻株為對象，采用脂肪抽提方法測定微藻細胞中的脂肪含量，然后，篩選出高含油量的藻株。脂肪抽提方法有：1)索氏抽提法：將微藻抽濾到0.45?μm的濾膜上(濾膜事先已烘至恒重，記作M。)，105℃烘5h(與烘干濾膜的條件相同)，測量抽提前的濾膜和微藻總質量(Ml)后，包入濾紙中，乙醚浸泡過夜，放入索氏抽提器的中結內，水浴加熱30℃，蒸發(fā)回流反復抽提10h以上，取出濾紙包，將濾膜烘干稱重記錄為M2。根據公式計算脂肪的含量：粗脂肪含量(％)＝(粗脂肪重量/硅藻干重)×100％＝(M1-M2)/(M1-Mo)×100％。2)氯仿-甲醇抽提法：稱取烘干的微藻樣品5克，放入200毫升具塞三角瓶中加入60毫升氯仿-甲醇混合液.連接布氏漏斗，于60度水浴中，從微沸開始計時提取1小時，提取結束后，取下三角瓶，用布氏漏斗過濾，濾液用另一具塞三角瓶收集，用氯仿-甲醇混合液洗滌燒瓶、濾器及濾器中的試樣殘渣，洗滌液并入濾液中，置于65～70℃水浴中回收溶劑，至三角瓶內物料顯濃稠態(tài)，但不能使其干涸，冷卻。用移液管加入25ml乙醚，再加入15克無水硫酸鈉，立刻加塞振蕩10分鐘，將醚層移入離心管中，以3000r/min離心5min進行分離。用移液管迅速吸取離心管中澄清的醚層10ml，于以衡重的稱量瓶內，蒸發(fā)去除石油醚后，于100～105℃烘箱中烘至衡重(約30分鐘)。根據公式計算脂肪的含量：脂類質量分數＝(稱量瓶與脂類質量-稱量瓶質量)×2.5(從25ml乙醇中取10ml進行干燥，故乘以系數2.5)/試樣質量×100％w＝(m2-m1)×2.5/m×100％。上述方法測定脂肪含量，微藻樣品需要量大，需要消耗大量的化學制劑，工序復雜，誤差較大，耗時較長。

對于含油量高、生長速率快、適合產業(yè)化生產的優(yōu)質微藻種質的大規(guī)模分離篩選，目前尚無高效系統的方法。

發(fā)明內容