[發明專利]一種快速篩選高油脂含量微藻種質的方法

無效

• 申請號: 200910164175.5
• 申請日: 2009-08-03
• 公開（公告）號: CN101624615A
• 公開（公告）日: 2010-01-13
• 發明（設計）人: 鄧曉東;張毅;費小雯
• 申請（專利權）人: 中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;C12R1/89
• 代理公司: ?？谙柘鑼＠聞沼邢薰?/td>
• 代理人: 莫 臻

1.一種快速篩選高油脂含量微藻種質的方法，其特征在于，具體步驟如下：

1)自然水體樣品的采集

自海洋、湖泊、河流或水塘采集有可能生長所需單胞藻的水體為水樣，然后將水樣經350目篩絹過濾以除去浮游生物；

2)樣品的培養分離

配制AE1，AE2，AE3，AE4四種培養基，將每種培養基按12個濃度梯度放入具有96孔的培養板中；將采集的自然水樣混勻，然后加入50-200μg/ml氨芐青霉素、50-100μg/ml卡那霉素和50-100μg/ml慶大霉素；將水樣按照1∶20的體積比分別接種于培養基AE1，AE2，AE3，AE4四種培養基中；將培養板置于溫度為21～28℃，光照強度為1500～5000LUX的條件下培養，利用不同的藻種最適培養基的成分和濃度之間的差異，在不同的培養基種類和濃度條件下就有不同的最適生長微藻，當某種微藻大量增殖，形成優勢種群后，在群落間的競爭背景下，非優勢種漸漸衰落，優勢種漸漸增強，最終非優勢種死亡，僅剩下優勢藻種生長，達到分離的目的；

上述四種培養基的成分如下：

①.AE1：NaNO₃?0.2～0.4g·L^-1，K₂HPO₄·3H₂O?0.05～0.08g·L^-1，MgSO₄·7H₂O?0.05～0.09g·L^-1，CaCl₂·2H₂O?0.02～0.05g·L^-1，KH₂PO₄0.1～0.3g·L^-1，NaCl?0.02～0.5g·L^-1，Soil?extract?40ml，FeCl₃·6H₂O?0.002～0.006g·L^-1，Fe-EDTA?0.05～0.1g·L^-1，H₃BO₃?2.0～3.0?g·L^-1，MnCl₂·4H₂O?1.0～2.0g·L^-1，ZnSO₄·7H₂O?0.15～O.30g·L^-1，CuSO₄·5H₂O?0.60～0.90g·L^-1，(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O?0.2～0.5g·L^-1；

②.AE2：NaNO₃?1～3g·L^-1，K₂HPO₄·3H₂O?0.03～0.05g·L^-1，MgSO₄·7H₂O?0.05～0.08g·L^-1，CaCl₂·2H₂O?0.03～0.05g·L^-1，citricacid?0.005～0.007g·L^-1，Ferric?ammonium?citrate?0.005～0.007g·L^-1，EDTA?0.001～0.002g·L^-1，Na₂CO₃?0.01～0.03g·L^-1，H₃BO₃?2.0～3.0g·L^-1，MnCl₂·4H₂O?1.0～2.0g·L^-1，ZnSO₄·7H₂O?0.15～0.30g·L^-1，CuSO₄·5H₂O?0.60～0.90g·L^-1，Na₂MoO₄·2H₂O?0.25～0.45g·L^-1，CoCl₂·6H₂O?0.03～0.05g·L^-1；

③.AE3：Tris?Base?2～3g·L^-1，Glacial?acetic?acid?1～3ml·L^-1，K₂HPO₄?0.1～0.2g·L^-1，KH₂PO₄?0.05～0.08g·L^-1，NH₄Cl?0.03～0.05g·L^-1，MgSO₄·7H₂O?0.01～0.02g·L^-1，CaCl₂·2H₂O?0.005～0.07g·L^-1，H₃PO₄?0.001～0.003g·L^-1，MnCl₂·4H₂O?0.004～0.006g·L^-1，ZnSO₄·7H₂O0.02～0.03g·L^-1，FeSO₄·7H₂O?0.004～0.006g·L^-1，CoCl₂·2H₂O?0.001～0.002g·L^-1，(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O?0.001～0.002g·L^-1；

④.AE4：NaNO₃?0.3～0.5g·L^-1，CO(NH₂)₂?0.1～0.3g·L^-1，K₂HPO₄·3H₂O?0.05～0.1g·L^-1，FeC₆H₅O₇?0.005～0.008g·L^-1，CaCl₂·2H₂O?0.02～0.3g·L^-1，Soil?extract?10ml·L^-1，Vb1?200～300ug·L^-1，Vb12?400～500ng·L^-1，H₃PO₄?0.001～0.003g·L^-1，MnCl₂·4H₂O?0.004～0.006g·L^-1，ZnSO₄·7H₂O?0.02～0.03g·L^-1，FeSO₄·7H₂O?0.004～0.006g·L^-1，CoCl₂·2H₂O?0.001～0.002g·L^-1，(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O?0.001～0.002g·L^-1；

3)生長速率和生物量的監測?

根據微藻細胞在490nm處的吸光值和細胞密度呈顯著的正相關性，吸收值越大，藻的濃度就越大；利用酶標儀檢測490nm處的吸光值來快速反映藻類的生長情況；每隔12～24小時用酶標儀監測光吸收值來快速反映藻類的生長情況，繪制每個培養小室的微藻生長曲線，計算生長速率，同時用倒置顯微鏡觀察藻細胞的生長狀況及培養純度；

4)樣品含油量的監測

監測藻細胞生長，待細胞生長到平臺期，根據微藻具有活體原位測定的特性，將微藻經尼羅紅染色后，用熒光酶標儀檢測光密度值以確定微藻的含油量，從而篩選到適合生產生物柴油的理想微藻種質；

5)微藻種質的最后純化和鏡檢

根據所篩選到的目的藻種相對應小室內的培養基的種類和濃度制做固體培養平板，取該小室的微藻做平板劃線，待長出單藻落后，從平板上挑取直徑較大的藻落再做一次平板劃線，得到生長速度較快和細胞體積較大的藻種的優秀藻株，同時在400X顯微鏡下觀察該種微藻的形態和均一度，最終確定為純種藻株后，做藻種保藏。?