[發明專利]一種β-葡聚糖酶的生產方法

有效

• 申請號: 200910163452.0
• 申請日: 2009-08-15
• 公開（公告）號: CN101993865A
• 公開（公告）日: 2011-03-30
• 發明（設計）人: 孫維國;李統鋒;顧克才;丁少明
• 申請（專利權）人: 白銀賽諾生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N9/24;C12R1/885
• 代理公司: 甘肅省知識產權事務中心 62100
• 代理人: 劉繼春

技術領域??本發明涉及一種β-葡聚糖酶(β-glucanase)的生產方法，屬于生物酶制劑生產技術領域。

背景技術??β-葡聚糖酶是非淀粉類水解酶，是水解β-葡聚糖分子中的(1→3)和(1→4)-β糖苷鍵，使之降解為小分子，失去親水性和黏性的產物。β-葡聚糖酶廣泛應用于啤酒、飼料、食品、醫藥、環保等工業，隨著國民經濟的快速發展，其用途越來越廣。

β-葡聚糖酶主要采用微生物發酵法生產；通常采用固體發酵法和液體深層發酵法。固體發酵法應用較早，由于其勞動強度大、控制難度大、產品質量尤其是衛生指標不穩定等原因，已逐步被液體深層發酵法取代；但液體深層發酵法投資大，生產成本高，其中主原料占到生產成本的60％；投一罐主原料僅僅發酵一次，所產生的濾渣少量用來作飼料添加劑，大部分廢棄。由于液體深層發酵法生產β-葡聚糖酶存在成本偏高問題，導致市場售價高，直接影響市場開發與產品應用。

發明內容??本發明的目的是提供一種重復利用濾渣，降低β-葡聚糖酶生產成本的β-葡聚糖酶的生產方法。

本發明實現上述目的所采取的技術方案是：

一種β-葡聚糖酶(β-glucanase)的生產方法，利用李氏木霉(Trichodermareesei)作為菌種，以微晶纖維素、玉米漿、磷酸二氫鉀、硫酸銨和碳酸鈣為原料，進行液體深層發酵生產β-葡聚糖酶，發酵濾液經板框過濾，得到濾渣與β-葡聚糖酶液；所得β-葡聚糖酶液再經過超濾濃縮和噴霧干燥后得粉狀β-葡聚糖酶產品；所得濾渣全部用于替代微晶纖維素作為主原料，重新進行液體深層發酵生產β-葡聚糖酶；循環反復，濾渣重復利用一至五次；具體包括下述步驟：

A、菌種制備與擴大培養

A.1將李氏木霉試管斜面菌種在無菌條件下轉入已制備好的以PDA為培養基的500ml茄瓶中，pH5.0～5.8；滅菌條件：121℃保溫30分鐘；28℃～30℃培養5～7天備用；

A.2用6立方米種子罐對菌種擴大培養

將工業級的微晶纖維素58～62kg、玉米漿73～78kg、磷酸二氫鉀17～19kg和硫酸銨14.5～15.5kg分別投入6立方米種子罐內，用自來水定容到2.8～3.2立方米；攪拌均勻；然后用蒸汽直接滅菌，120～121℃保溫30～33分鐘，再降溫到30～32℃；接入按步驟A.1所得的6瓶500ml茄瓶的李氏木霉菌種；在風量為1∶0.6、溫度為30℃～32℃，罐壓力為0.06～0.08Mpa條件下培養32～36小時，得擴大培養的李氏木霉菌種備用；

B、用60立方米發酵罐發酵生產β-葡聚糖酶

B.1將工業級的微晶纖維素2300～2450kg、玉米漿950～1050kg、磷酸二氫鉀230～250kg、硫酸銨190～210kg與碳酸鈣19～21kg分別投入60立方米發酵罐內，用自來水定容到39～42立方米；攪拌均勻，PH4.0；然后用蒸汽直接滅菌，113～115℃保溫30～33分鐘，再降溫到29～31℃；將步驟A.2所得擴大培養的李氏木霉菌種全部接入；在風量比為1∶0.17～0.18、溫度為27℃～29℃，罐壓力為0.06～0.08Mpa條件下培養138～148小時，得發酵液；利用板框過濾機將發酵液進行固液分離，得一次濾渣與β-葡聚糖酶清液；所述風量比是一立方米發酵液與每分鐘所需要的進氣量之比；

B.2將步驟B.1所得的含水量為42～50％的全部一次濾渣，玉米漿880～930kg，磷酸二氫鉀190～210kg，硫酸銨152～168kg與碳酸鈣15.5～16.5kg分別投入60立方米發酵罐內，用自來水定容到39～42立方米；攪拌均勻，PH4.0，然后用蒸汽直接滅菌，113～115℃保溫30～33分鐘，再降溫到29～31℃，接入按步驟A.2制備的另一罐6立方米種子罐擴大培養的李氏木霉菌種，在風量為1∶0.17～0.18、溫度為27℃～29℃，罐壓力為0.06～0.08Mpa條件下培養138～148小時，得發酵液；利用板框過濾機將發酵液進行固液分離，得二次濾渣與β-葡聚糖酶清液。

C、β-葡聚糖酶的提純

將步驟B.1或B.2所得β-葡聚糖酶清液采用分子量為10000道爾頓的超濾膜進行濃縮至9～11倍；然后采用壓力式噴霧塔噴霧干燥；工藝條件：進口溫度125～135℃，出口溫度55～60℃，干燥所得即為粉狀β-葡聚糖酶產品。

為了隨時掌握所生產的β-葡聚糖酶的質量技術指標，本發明還包括步驟：

D、β-葡聚糖酶的檢測