[發(fā)明專利]非小細(xì)胞肺癌檢測(cè)方法及試劑盒

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910163061.9
• 申請(qǐng)日: 2009-08-21
• 公開（公告）號(hào): CN101993951A
• 公開（公告）日: 2011-03-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馮長(zhǎng)訪;趙冬燕;王保君
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 馮長(zhǎng)訪;趙冬燕;王保君
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域中一種非小細(xì)胞肺癌的檢測(cè)方法及試劑盒，可用于非小細(xì)胞肺癌的判別及臨床檢測(cè)。

背景技術(shù)

癌癥是嚴(yán)重威脅人類生命和社會(huì)發(fā)展的重大疾病，已成為人類死亡的重要原因，2015年全球預(yù)計(jì)有900萬(wàn)人死于癌癥，2030年這個(gè)數(shù)字將達(dá)到1140萬(wàn)人。2004年-2005年中國(guó)第三次全死因調(diào)查顯示，我國(guó)城鄉(xiāng)居民癌癥死亡率為135.88/10萬(wàn)，屬世界較高水平，而且仍呈持續(xù)增長(zhǎng)的趨勢(shì)。癌癥死亡率比上世紀(jì)70年代增加了83.1％，比90年代初期增加了22.5％。

肺癌是發(fā)病率和死亡率最高的一種癌癥，其臨床上分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌，其中小細(xì)胞肺癌占17％，非小細(xì)胞肺癌占83％，不同的肺癌類型需要與之相適應(yīng)的治療方法，所以肺癌的分型診斷是肺癌治療中的關(guān)鍵。以往采用影像學(xué)或檢測(cè)血液中的傳統(tǒng)標(biāo)志物來(lái)檢查肺癌，皆存在準(zhǔn)確率低的問(wèn)題。病理學(xué)檢查雖然可以準(zhǔn)確地確認(rèn)肺癌及肺癌的類型，但因其需要開胸手術(shù)取材而不能作為檢查的常規(guī)手段。

miRNA(microRNA)是一類非編碼、內(nèi)源性的小RNA，長(zhǎng)約21～25核苷酸(nucleotides，nt)。目前已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)并被miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的人類miRNA有695種，絕大多數(shù)miRNA可以通過(guò)與靶基因的3-UTR區(qū)互補(bǔ)結(jié)合，抑制靶基因翻譯成蛋白質(zhì)，進(jìn)而在細(xì)胞及組織水平影響生物體的發(fā)育，并參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。一系列的研究表明miRNA在細(xì)胞成長(zhǎng)、細(xì)胞分化及凋亡、同源異性盒基因調(diào)節(jié)、神經(jīng)元極性、胰島素分泌、胚胎發(fā)育中的大腦形成及心臟發(fā)生、代謝等過(guò)程中都發(fā)揮著重要作用。成熟miRNA作為體液中客觀存在的標(biāo)志物，其表達(dá)量的檢測(cè)也將有很重要的臨床意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種通過(guò)特異性定量檢測(cè)標(biāo)本中成熟miRNA的含量來(lái)判別非小細(xì)胞肺癌的簡(jiǎn)便、實(shí)用的方法及成套的試劑盒，可用于非小細(xì)胞肺癌的類型分析及臨床檢測(cè)。

本發(fā)明所涉及的非小細(xì)胞肺癌檢測(cè)方法，其特征在于：提取總RNA(含miRNA)，以發(fā)卡結(jié)構(gòu)引物在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下合成cDNA，以miRNA特異性正向引物及通用反向引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR定量檢測(cè)成標(biāo)本中特定成熟miRNA的含量，判別非小細(xì)胞肺癌的有無(wú)和類型。該檢測(cè)方法通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：(1)總RNA提取：A、樣品處理；B、RNA分離；C、RNA沉淀；D、RNA洗滌；E、RNA溶解；F、RNA濃度測(cè)定；G、RNA電泳檢測(cè)。(2)RNA的逆轉(zhuǎn)錄：以一個(gè)包含20-230nt長(zhǎng)度的發(fā)卡序列和6-30nt特異性序列的引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，擴(kuò)增相應(yīng)的成熟miRNA的第一鏈cDNA。(3)熒光定量PCR檢測(cè)：以miRNA特異性正向引物及通用反向引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR定量檢測(cè)標(biāo)本中特定成熟miRNA的含量。下面將通過(guò)一個(gè)具體實(shí)施方式詳細(xì)描述該技術(shù)方案。

該技術(shù)有以下優(yōu)點(diǎn)：高度特異性，特異的發(fā)卡反轉(zhuǎn)錄引物確保反應(yīng)不受其前體及基因組DNA污染等因素的干擾，對(duì)序列高度同源的miRNA也可精確區(qū)分；樣品消耗少，僅需1～10ng的總RNA；簡(jiǎn)便快捷，可同時(shí)判斷非小細(xì)胞肺癌的有無(wú)及類型。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例一

非小細(xì)胞肺癌的檢測(cè)

1、總RNA提取

(1)樣品處理：取待檢患者100μL～500μL血液標(biāo)本，加1mL?TRIzol試劑，反復(fù)混勻；

(2)RNA分離：室溫放置上述樣品液10分鐘，加入氯仿200μL，劇烈振蕩約1分鐘，室溫靜置5分鐘，4℃12000g離心15分鐘，小心取出樣品，通過(guò)觀察可以發(fā)現(xiàn)樣品分三層，其中最上層含有RNA組份；

(3)RNA沉淀：小心吸取上清液約450μL至含有600μL冰冷異丙醇的新離心管中，混勻，4℃12000g離心10分鐘；

(4)RNA洗滌：去上清，加入500μL冷凍的75％乙醇，彈起沉淀，4℃12000g離心5分鐘，去上清，4℃12000g再離心5分鐘，吸去上清液；

(5)RNA溶解：風(fēng)干約5～10分鐘，加入DEPC處理水約30μL，溶解RNA；

(6)RNA濃度測(cè)定：吸取1μL?RNA用DEPC水稀釋10倍后，在微量分光光度計(jì)上測(cè)定RNA濃度，以DEPC水做空白對(duì)照，同時(shí)記錄RNA濃度及其OD₂₆₀/OD₂₈₀，按照公式計(jì)算RNA濃度，RNA濃度＝40ng/μL×OD₂₆₀×稀釋倍數(shù)；