[發明專利]乳清蛋白的分離和測定方法

有效

• 申請號: 200910161153.3
• 申請日: 2009-08-06
• 公開（公告）號: CN101613408A
• 公開（公告）日: 2009-12-30
• 發明（設計）人: 任一平;謝宏;蔡增軒;儲小軍;林曉;黃百芬;張京順
• 申請（專利權）人: 浙江貝因美科工貿股份有限公司
• 主分類號: C07K14/76
• 分類號: C07K14/76;C07K14/47;C07K1/16;G01N30/72
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司
• 代理人: 陳劍華

技術領域

本發明涉及一種乳清蛋白的分離和測定方法。更具體地說，涉及一種能夠高 效地將牛乳和乳制品中的牛乳白蛋白和牛乳球蛋白完全分離并定量測定的方法。

背景技術

一般牛乳中含2.2％～4.4％的蛋白質，主要為酪蛋白、乳清蛋白、脂肪球膜蛋 白等。乳清蛋白含量僅次于酪蛋白，占牛乳中蛋白質含量的18％～20％，其包括β -乳球蛋白、α-乳白蛋白、血清白蛋白、免疫球蛋白等及一些生長因子，其中β -乳球蛋白和α-乳白蛋白是乳清蛋白的主要成分，約占其75％。因此，對牛乳和 牛乳制品中的乳清蛋白準確定量對于牛乳和牛乳制品的質量評價和控制具有重要 的意義。

現有的乳清蛋白的檢測方法有：聚丙烯酰胺平板凝膠電泳法(SDS-PAGE)、 毛細管凝膠電泳法(CGE)、高效液相色譜法(包括反相色譜法和凝膠色譜法)和 液相色譜質譜聯用法(LC-MS)。

毛細管凝膠電泳(CGE)是將平板凝膠電泳在毛細管中實現。CGE分離變性 蛋白依賴于帶不同負電荷的蛋白質在電場中遷移速度的不同得以實現，不需要染 色，蛋白的檢測通過紫外吸收來完成定量檢測。然而，CGE受到毛細管短、電壓 等限制，不能很好地分離分子量差別很小的蛋白，同時靈敏度較低。聚丙烯酰胺 平板凝膠電泳法(SDS-PAGE)一直以來在生化領域被廣泛應用于分離蛋白質、寡 核苷酸等生物大分子。它的定量是通過掃描經染色后的蛋白質在凝膠上的染色程 度來實現的。雖然該方法能夠分離各種乳清蛋白，但其操作步驟復雜，檢驗周期 長，鄰近帶型的界面不清楚，不同批次間的染色和脫色存在誤差，很難獲得良好 的重現性，因此只能半定量，從而限制了其使用。

反相高效液相色譜法(RP-HPLC)采用紫外吸收來進行定量。但由于蛋白質 分子量一般都在萬級以上，很多有亞基結構，立體構型及復雜構象，與流動相、 固定相及樣品中的其它成分甚至蛋白質本身都可能存在多種復雜的相互作用，會 造成譜帶擴散、峰形拖尾等問題，甚至發生變性和不可逆吸附，引起回收率和分 辨率降低，并且隨著蛋白質體積和疏水性的增加，純化難度也會增加。

凝膠色譜(GPC)是一種物理性分離方式。GPC分離蛋白依賴于不同分子量 的蛋白質在色譜柱中遷移速度不同而實現分離，不需要變性、染色，蛋白的檢測 通過280nm的紫外吸收來實現，所以在蛋白的定量分析上更可靠。在乳清蛋白中， β-乳球蛋白(β-Lg)的分子量較α-乳白蛋白(α-La)大4000道爾頓左右，在 GPC中可以實現分離，并且運用紫外吸收來定量。但GPC受到分辨率低的限制， 不能同時很好地分離分子量差別較小的蛋白質，例如牛β-乳球蛋白(β-Lg)的兩 個主要遺傳變異體βb-乳球蛋白(βb-Lg)和βa-乳球蛋白(βa-Lg)的分子量分 別為18276.9道爾頓和18362.9道爾頓，兩者僅差90道爾頓左右，因此無法通過 GPC進行有效分離。

液相色譜質譜聯用技術(LC-MS)是近十年來興起的新技術，與其他色譜方 法比起來具有更高的選擇性和靈敏度。Czerwenka等采用LC-MS聯用方法測定牛 乳和乳制品中β-牛乳球蛋白的含量，選用ESI(+)，全掃描的提取離子方式。但 Czerwenka等只測定了總的牛β-乳球蛋白含量，未涉及牛乳中α-乳白蛋白的分 離和定量(參見Christoph?C.et?al，Analytical?Chemistry，2007，79(14)，5165-5172)。

因此，本領域需要一種能夠高效將牛乳和乳制品中的牛乳白蛋白和牛乳球蛋 白完全分離并準確定量的方法。

發明內容

因此，本發明的目的在于提供一種能夠高效地將牛乳和乳制品中的未變性的α -乳白蛋白(牛α-La)和牛βa-乳球蛋白(βa-Lg)、牛βb-乳球蛋白(βb-Lg) 完全分離的方法和將分離出來的這些蛋白進行準確定量的方法。

本發明的乳清蛋白的分離方法包括：

對乳清蛋白進行預處理，

用以1.7μm亞乙基橋雜化(BEH)顆粒為填料的超高效液相色譜柱將試樣中 的牛α-乳白蛋白和牛βa-乳球蛋白、牛βb-乳球蛋白完全分離。

在上述分離方法中，作為所述以1.7μm亞乙基橋雜化(BEH)顆粒為填料的 超高效液相色譜柱，優選采用ACQUITY?UPLC?BEH300?C18柱，并且以含三氟乙 酸的水和含三氟乙酸的乙腈溶液為流動相進行梯度分離。