[發(fā)明專利]一種適用于組織培養(yǎng)基的低酰基結(jié)冷膠提取方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910158365.6
• 申請日: 2009-07-09
• 公開（公告）號: CN101591399A
• 公開（公告）日: 2009-12-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 吳炳華;朱正學(xué);王雪剛;王佳良;包圣強;沈孝琴
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江中肯生物科技有限公司
• 主分類號: C08B37/00
• 分類號: C08B37/00;C12S3/02
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物提取領(lǐng)域，特別是一種適用于組織培養(yǎng)基的低酰基結(jié)冷膠的后提 取方法。

背景技術(shù)

結(jié)冷膠是一種從自然界中通過廣泛篩選分離的細菌----少動鞘脂單胞菌 (Sphingomonas?paucimobilis)發(fā)酵生產(chǎn)而來的親水性膠體，具有多種有用的特性。

結(jié)冷膠的分子基本結(jié)構(gòu)是一條主鏈，由重復(fù)的四糖單元構(gòu)成，參與形成的單糖有葡 萄糖、鼠李糖及葡萄糖醛酸。在結(jié)冷膠的原始形態(tài)即高酰基結(jié)冷膠中，兩種取代基-- 乙酰取代基和甘油酰取代基都是存在的。兩個基團都位于相同的葡萄糖殘基上，每個重 復(fù)單元有一個甘油酰取代基，每兩個重復(fù)單元有一個乙酰取代基。在低酰基結(jié)冷膠中， 酰基基團被徹底移除。酰基基團對凝膠的性質(zhì)有很顯著的影響，高酰基型可以產(chǎn)生柔軟、 富有彈性和不具有脆性的凝膠，而低酰基結(jié)冷膠產(chǎn)生的是堅實、不具有彈性，但是很脆 的凝膠。

目前，組織培養(yǎng)基中的凝膠劑一般都使用瓊脂。但是，瓊脂中的雜質(zhì)以及阻礙因素 (包括硫元素)會影響植物組織的生長，因此低酰基清型結(jié)冷膠產(chǎn)品是一種很有前途的 瓊脂替代產(chǎn)品。因為結(jié)冷膠純度很高，而且是工業(yè)發(fā)酵法生產(chǎn)，相對于從海藻中提取的 瓊脂來說，產(chǎn)品品質(zhì)要更加穩(wěn)定。結(jié)冷膠配成溶液后凝膠時間相對瓊脂要短，這樣能節(jié) 省時間；同時，結(jié)冷膠在高溫狀態(tài)下非常穩(wěn)定，很適合嗜熱微生物的培養(yǎng)。在某些植物 組織的培養(yǎng)試驗中發(fā)現(xiàn)，使用了結(jié)冷膠的培養(yǎng)基可以加速組織的生長。另外，結(jié)冷膠的 使用量只是瓊脂的1/3，同時還可以抗霉菌的污染，在移植過程中很容易清洗。另外， 由于結(jié)冷膠形成的凝膠具有極高的透光度，使用結(jié)冷膠還可以方便的觀察到根系以及組 織生長的情況。因此，低酰基結(jié)冷膠在組織培養(yǎng)基中具有廣闊的應(yīng)用前景。

目前，工業(yè)生產(chǎn)的食品級低酰基結(jié)冷膠雖然可以用在組織培養(yǎng)基產(chǎn)品中，但相對于 美國斯比凱可公司GELZAN^TM?CM型號結(jié)冷膠和Sigma公司的Phytagel號型結(jié)冷膠，國 產(chǎn)食品級結(jié)冷膠在培養(yǎng)基中的應(yīng)用還存在很多問題，具體表現(xiàn)如下：

1.食品級低酰基結(jié)冷膠溶解性能比較差，分散性不好，容易抱團，水合溫度需在 80℃以上。而國外的培養(yǎng)基型號結(jié)冷膠分散性好，水合溫度在60℃左右。

2.一般食品級結(jié)冷膠在具體使用過程中需要嚴格遵守先溶解膠體再加入金屬離子 的順序，如果將結(jié)冷膠粉末和金屬鹽混合后再溶解則會導(dǎo)致溶解非常困難同時產(chǎn)生大量 乳白色絮狀物。而國外培養(yǎng)基型號的結(jié)冷膠則不存在這種問題。

3.一般食品級結(jié)冷膠強度在900g/cm²以上，而國外培養(yǎng)基型號結(jié)冷膠強度在 400～600g/cm²之間；同時一般食品級結(jié)冷膠透光度在85％左右，而國外培養(yǎng)基型號結(jié) 冷膠透光度大于90％。

發(fā)明內(nèi)容

鑒于上面普通食品級低酰基清型結(jié)冷膠在組織培養(yǎng)基應(yīng)用上存在的不足之處，本發(fā) 明的目的在于提供一種新的生產(chǎn)適用于組織培養(yǎng)基的低酰基清型結(jié)冷膠的方法。

本發(fā)明的適用于組織培養(yǎng)基的低酰基清型結(jié)冷膠提取方法包括結(jié)冷膠發(fā)酵液的脫酰 基處理、酶處理、二價或多價金屬陽離子絮凝低酰基狀態(tài)結(jié)冷膠、結(jié)冷膠溶液澄清處理、 結(jié)冷膠溶液脫水處理、脫色及離子交換處理、配入適當質(zhì)量的螯合劑/酸體系以螯合在 結(jié)冷膠使用過程中可能額外加入的二價陽離子同時保持pH值的相對穩(wěn)定、干燥及粉碎， 其具體步驟為：

(1)發(fā)酵液的脫酰基處理

將發(fā)酵液溫度升至80～90℃，加入抗氧化劑，同時加入堿調(diào)節(jié)pH值脫酰基；

(2)發(fā)酵液的酶處理；

在步驟(1)發(fā)酵液中加入不同酶制劑，以盡可能地除去發(fā)酵液中不溶性的雜質(zhì)和 菌體碎片；更具體地為，加入一種酶制劑保溫酶解后，再加入另一種酶保溫酶解， 依此類推；

(3)發(fā)酵液的絮凝；

在步驟(2)酶處理后的發(fā)酵液中，加入水溶性堿金屬絮凝，再調(diào)節(jié)pH值至堿性， 固液分離，以除去發(fā)酵液中大部分水以及色素，得到濃縮的結(jié)冷膠粗品；

(4)結(jié)冷膠澄清處理

將步驟(3)得到的結(jié)冷膠粗品通過澄清處理，得到澄清的低酰基結(jié)冷膠溶液；

(5)脫酰基結(jié)冷膠溶液脫水處理

在步驟(4)得到的結(jié)冷膠脫酰基澄清溶液中，通過加入堿金屬離子形成凝膠，壓榨 脫水；

(6)離子交換及脫色處理