[發明專利]一種高產聚谷氨酸工程菌株的構建方法

無效

• 申請號: 200910157763.6
• 申請日: 2009-07-27
• 公開（公告）號: CN101967494A
• 公開（公告）日: 2011-02-09
• 發明（設計）人: 蘇移山;朱希強;張曉員;侯重文;郭學平;凌沛學
• 申請（專利權）人: 山東省生物藥物研究院
• 主分類號: C12N15/75
• 分類號: C12N15/75;C12P13/02;C12R1/125
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技術領域

本發明涉及應用微生物和發酵工程領域中一種重組γ-聚谷氨酸生產菌及其構建方法與利用該菌發酵生產γ-聚谷氨酸的應用，屬于生物技術領域。

背景技術

γ-聚谷氨酸(聚-γ-谷氨酸，poly-γ-glutamic?acid，簡稱PGA)是自然界中微生物發酵產生的水溶性多聚氨基酸，其結構為谷氨酸單元通過α-氨基和γ-羧基形成肽鍵的高分子聚合物。分子量分布在100kDa到10000kDa之間。聚-γ-谷氨酸具有優良的水溶性、超強的吸附性和生物可降解性，降解產物為無公害的谷氨酸，是一種優良的環保型高分子材料，可作為保水劑、重金屬離子吸附劑、絮凝劑、緩釋劑以及藥物載體等，在化妝品、環境保護、食品、醫藥、農業、沙漠治理等產業均有很大的商業價值和社會價值。

PGA作為具有廣泛應用前景的生物大分子物質，其生產主要包括以下幾種方式：化學合成法，提取法和微生物發酵法。化學合成法制備PGA面臨的主要問題是工藝路線較長，副產物多，收率低，難于滿足市場的需求。因此該方法不具備實際應用價值。提取法制備PGA的過程相對較為簡單。該方法的主要缺點是上述菌體中節含量較低且不穩定，因此該方法制備PGA的產量較低，成本較高，不利于工業化大生產。

微生物發酵法是通過某些微生物的發酵培養生產PGA，與上述的多種方法相比，具有培養條件溫和，周期較短，PGA產量高且分子量分布合適等優點，已經成為國內外研究的熱點。微生物發酵法是目前制備PGA最具有工業化前景的生產方法。日本味之素株式會社和臺灣味丹企業已經利用該方法進行PGA的商業化試生產。但是由于微生物中PGA的合成代謝途徑較為復雜，涉及能量代謝，發酵液中PGA濃度相對較低，而且發酵液的黏度較高，限制了對氧的利用率，因此導致PGA產率較低。

透明顫菌血紅蛋白(Vitreoscilla?hemoglobin，VHb)是原核生物中迄今發現的唯一的一種血紅蛋白。該蛋白能夠從分子水平上提高基因克隆菌對氧氣的利用能力，在貧氧環境中，能夠誘導透明顫菌血紅蛋白基因的表達，促進微生物細胞胞內氧的傳輸，提高氧的利用率，在限氧條件下，對許多宿主細胞的生長都有明顯的促進作用。因此可以利用VHb的分子克隆來解決高黏度發酵過程中的供氧問題。

發明內容

本發明的目的是提供一種γ-聚谷氨酸生產工程菌株的構建方法，該工程菌株可在較低溶氧水平下大幅度提高γ-聚谷氨酸的產量。

本發明所提供的高產γ-聚谷氨酸的工程菌，是將含有啟動子、同源重組序列和篩選標記的透明顫菌血紅蛋白基因重組到γ-聚谷氨酸生產菌株-枯草芽孢桿菌或其他可用來生產γ-聚谷氨酸的菌株的基因組上，經篩選得到的高產γ-聚谷氨酸的工程菌株。上述透明顫菌基因具有GENBANK?Aceession?Number為M30794的5′端第142-582位核苷酸序列。

上述的透明顫菌血紅蛋白基因的5′端連接有P43啟動子，P43啟動子具有GENBANKAceession?Number為K02174的5′端第1～476位核苷酸序列，其可在聚谷氨酸生產菌中啟動下游基因的表達。透明顫菌血紅蛋白基因含有的同源重組序列為淀粉酶(amyE)位點或lacA位點，篩選標記為氯霉素抗性基因。

本發明中的γ-聚谷氨酸生產菌株為枯草芽孢桿菌或其他可用來生產γ-聚谷氨酸的菌株，特別指枯草芽孢桿菌。

本發明將透明顫菌血紅蛋白基因構建枯草芽孢桿菌同源重組載體為pBluescriptsk(+)-amyE-P43-vgb-cat-amyE，又名為pSK-P43-vgb。重組載體pSK-P43-vgb可通過電轉化方法導入γ-聚谷氨酸生產菌株內。

附圖說明

附圖為pBluescriptsk(+)-amyE-P43-vgb-cat-amyE的結構圖。

具體實施方式

下述實施例中所用的方法無特別說明均為常規方法。

實施例一：表達血紅蛋白基因的枯草芽孢桿菌整合載體的構建