[發明專利]單管中多重靶核酸的PCR檢測方法及其試劑盒

有效

• 申請號: 200910157409.3
• 申請日: 2009-07-24
• 公開（公告）號: CN101624629A
• 公開（公告）日: 2010-01-13
• 發明（設計）人: 張文艷;葉成果;龔華斐;楊國翠;李振勇;黃道培
• 申請（專利權）人: 上海浩源生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64;C12Q1/70;C12R1/93
• 代理公司: 北京萬科園知識產權代理有限責任公司
• 代理人: 張亞軍;孫張巖

技術領域

本發明屬于核酸檢測技術領域，具體而言，本發明涉及在單個PCR反應容器中多重檢測 樣品中靶核酸的PCR方法。另外，本發明還涉及上述PCR方法中所涉及的試劑，如內對照、 引物、探針等，以及用于上述方法的檢測試劑盒和相應檢測試劑盒的制備應用等。

背景技術

聚合酶鏈反應(PCR)是當今核酸檢測中最常用的技術之一，其中實時(Real?Time)PCR 技術采用了諸如熒光標記等可實時檢測的標記，在核酸檢測、臨床診斷及分子生物學研究等 方面的功用顯得越來重要。這類技術目前應用領域非常廣泛，已經在實驗室研究、食品安全、 醫藥衛生等眾多行業中得以使用了。除了常規的實時PCR檢測，近年來人們對實時PCR檢 測也做了大量改進工作。例如，中國專利申請CN1768151A、CN101189505A、CN101273262A、 CN101302473A等均記載了對傳統的實時PCR的改進。但是，傳統和改進的實時PCR(尤其 是實時熒光PCR)在進行實際樣品的檢測時，即使僅檢測單一靶核酸，也必須面對樣品中可 能存在的多種核苷酸對檢測結果的干擾；當在單個PCR反應容器中進行多重靶核酸檢測(即 同時檢測多種靶核酸)時，由于要同時引入檢測不同種靶核酸的引物和探針，因此還進一步 需要面對不同的引物和探針的相互干擾的問題。而面對這些難題，現有技術中往往采用操作 復雜、成本高的處理手段，甚至某些無法引入內對照監測系統來排除假陰性，或者引入的內 對照(分子)本身(通常是核酸)進一步加劇了與多種靶核酸、引物及其探針之間的相互干 擾。

為了克服現有技術的不足，經過長期艱苦努力，本發明人令人驚訝地通過優選結果判別 方法、優化樣品處理方法、選擇內對照基因并任選包裝成病毒樣顆粒、和/或篩選出了引物和 不同波長區域的熒光標記的探針，開發出了在單個PCR反應容器(如，單個PCR反應管) 中多重檢測樣品中靶核酸的PCR方法，克服了實時熒光PCR開發中普遍遇到的多重引物/探 針容易交叉污染及靈敏度相對低的技術難點，而且對于單管檢測，操作方便并節省成本，同 時采用全程內對照監控系統，保證試驗的準確性。經過大量樣本的驗證，結果可靠，而且使 用目前常規的市售實時熒光PCR設備，無需改造，就能使其特異性、靈敏度、重復性等技術 指標均達到國際先進水平。另外，本發明人還發明了用于上述方法的試劑，如內對照、引物、 探針等，以及檢測試劑盒和相應檢測試劑盒的制備應用等。

發明內容

本發明的目的在于提供在單個PCR反應容器中多重檢測樣品中靶核酸的實時PCR方法， 該方法通過優化結果判別方法、優化樣品處理方法、優化內對照基因并優化其包裝形式、和/ 或優化出互不干擾的引物、探針以及熒光標記，可以在單個PCR反應容器中同時分辨出樣品 中是否存在的不同種靶核酸，尤其可以同時分辨出RNA和DNA靶核酸，而無需專門設備或 試劑，也無需引入復雜實驗步驟，就能得到高特異性、靈敏度和重復性的結果。另外，本發 明的目的還在于提供上述方法的檢測試劑盒和相應檢測試劑盒的制備應用等。

具體而言，在第一方面，本發明提供了在單個PCR反應容器中多重檢測樣品中一種或幾 種靶核酸的實時PCR方法，其包括，

(1)在所述單個PCR反應容器中混合樣品、DNA聚合酶、dNTP(即dATP、dCTP、dGTP 和dTTP)、內對照核酸、靶核酸引物對、內對照核酸引物對、一種或幾種靶核酸探針和內對 照核酸探針，其中前述各種探針標記有熒光基團和淬滅基團，而且各種探針標記的熒光基團 的熒光檢測波長互不相同；

(2)進行PCR反應，并實時檢測不同波長的熒光；和

(3)根據熒光檢測結果計算出的Ct值判斷是否有一種或幾種靶核酸存在于樣品中。