[發明專利]法呢基焦磷酸合成酶RNA干擾重組慢病毒載體構建及用途

有效

• 申請號: 200910156609.7
• 申請日: 2009-12-29
• 公開（公告）號: CN101805750A
• 公開（公告）日: 2010-08-18
• 發明（設計）人: 胡申江;葉煬
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/113;A61K48/00;A61P9/00;A61P3/00
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 張法高;趙杭麗

技術領域

本發明屬分子生物學，生物醫藥及基因工程技術領域，主要涉及針對法呢 基焦磷酸合成酶(Farnesylpyrophosphate?synthase，FDS)基因的RNA干擾重組慢 病毒載體(LV-sh-FDS)的構建及其在心肌肥厚和膽固醇代謝調控中的應用。

背景技術

目前研究表明小G蛋白參與心肌肥厚的發生。RhoA屬于小G蛋白的超家 族成員，有GDP結合的非活性態和GTP結合的活性態兩種形式。目前很多研 究表明RhoA參與心肌肥厚的發生如血管緊張素II(Ang?II)誘導的心肌肥厚。 有研究發現過表達Rho-GDI(Rho-GDP分離抑制體)及Rho抑制劑C3 exeoezyme可以明顯抑制Ang?II誘導的心肌肥厚。

法呢基焦磷酸合成酶(Farnesylpyrophosphate?synthase，FDS)是甲羥戊酸途 徑中的關鍵酶，甲羥戊酸途徑是哺乳動物體內膽固醇合成的唯一途徑。同時 FDS也是異戊二烯途徑中的關鍵酶，分解產生的類異戊二烯中間產物為RhoA 活化進而發揮功能提供了重要的底物。我們前期的實驗表明在培養的乳鼠心肌 細胞用1μM?Ang?II誘導的心肌肥厚模型及自發性高血壓大鼠(SHRs)肥厚心 肌(該模型心肌中含有高濃度的Ang?II)，FDS抑制劑阿倫磷酸鈉可以通過明 顯抑制RhoA活性來抑制心肌肥厚。這些充分顯示了FDS在心肌中調節RhoA 活性及在心肌肥厚中的可能重要作用。另外我們的研究也表明在培養的乳鼠心 肌細胞中用1μM?Ang?II孵育12-48h，FDS基因得到上調，尤其在24h最為 明顯。同時在18周自發性高血壓大鼠(SHRs)肥厚心肌中也發現了FDS基因 的上調。這些前期研究表明了FDS在心肌肥厚中可能的重要作用。

FDS在其他領域的研究中也表現出相當的重要性。生物學研究顯示通過抑 制FDS的表達，寄生蟲生長速度下降直至最后死亡。另外也有研究表明大鼠 前列腺癌細胞中發現FDS高表達。另研究顯示下調FDS的表達能通過Vγ9Vδ2 T細胞介導的免疫監視作用來靶向治療腫瘤細胞。

所有這些證據表明抑制FDS基因的表達可能阻止Ang?II相關的心肌細胞/ 組織肥厚反應。

RNA干擾(RNA?interference，RNAi)技術是抑制基因表達的常用手段， 又叫基因沉默。RNA干擾的原理是當細胞中導入與內源性mRNA編碼區同源 的雙鏈RNA時，該mRNA發生降解而導致基因表達沉默的現象。

RNA干擾過程主要有兩個步驟：一、雙鏈RNA被細胞源性雙鏈RNA特 異性的核酸酶切成21-23個堿基對的短雙鏈RNA，即小干擾RNA(small interference?RNA，siRNA)二、siRNA的反義鏈與核酸酶形成了沉默復合物 (RNA-induced?silencing?complex，RISC)，該復合體具有識別結合與小干擾 RNA有同源序列的mRNA，并在特異位點將該mRNA切斷。RNA干擾技術 目前在基因治療及研究中得到了廣泛的應用，同時那些在靶標實驗中證明有效 的siRNA/shRNA本身可以進一步開發成為RNAi藥物。shRNA即短發夾RNA (short?hairpin?RNA)包含兩個短反向重復序列(其中一個與目的基因互補)， 中間loop序列分隔組成發夾結構。在體內shRNA被加工成siRNA有效降解目 的基因抑制其表達。但是要將該技術應用于臨床治療，需要解決RNA干擾片 段表達持續及表達效率等重要問題。

目前基因治療的載體主要有非病毒載體及病毒載體，然而非病毒載體無法 滿足長時間的表達，這一缺陷無疑被病毒載體填補。近年來慢病毒介導的RNA 干擾技術在研究中已經取得了良好的開端。慢病毒載體是逆轉錄病毒的一種， 具有逆轉錄病毒的基本結構，但又有不同逆轉錄病毒的組分特性，該病毒既可 以轉染分裂細胞又可以轉染非分裂細胞。病毒基因組可以整合宿主中，使得基 因長時間穩定的表達，并且慢病毒具有較低的免疫源性，這使得慢病毒成為 RNA干擾的最佳載體，目前廣泛用于基因表達調控，基因治療等領域。我們選 用的是第三代復制缺陷型慢病毒載體是自殺性病毒(SIN)，在體內可以較長期 的表達且安全性高。因此慢病毒載體介導的RNA干擾效應在靶細胞內長期存 在，可為更好發揮干擾作用創造條件。

發明內容