[發(fā)明專利]兩段流加式高密度發(fā)酵合成聚羥基苯烷酸酯的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910155703.0
• 申請日: 2009-12-15
• 公開（公告）號: CN101717798A
• 公開（公告）日: 2010-06-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 尚龍安;張艷輝;陳效寧;任紅;姜岷;田頻源
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)寧波理工學(xué)院
• 主分類號: C12P7/62
• 分類號: C12P7/62;C12R1/40
• 代理公司: 寧波市鄞州甬致專利代理事務(wù)所 33228
• 代理人: 代忠炯

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種兩段流加式高密度發(fā)酵合成聚羥基苯烷酸酯的方法。

背景技術(shù)

聚羥基烷酸酯具有生物可降解性、生物可再生性、生物相容性以及降解產(chǎn)物無毒性等優(yōu)良特性，使得它可以被用作藥物緩釋載體、外科手術(shù)縫合線、人工血管、人工膀胱、人工心瓣膜等材質(zhì)及其相關(guān)的應(yīng)用。但所用的聚羥基烷酸酯大多都是聚羥基丁酸或羥基丁酸與羥基戊酸的共聚物，其中都不含有像苯基這樣的功能團(tuán)。近來，臨床醫(yī)學(xué)研究表明：含苯基功能團(tuán)的有機(jī)物苯乙酸和苯丁酸等具有抗腫瘤、鎮(zhèn)痛和化學(xué)預(yù)防治療等功能。如果將苯基功能團(tuán)引入生物高分子聚合材料----聚羥基烷酸酯中，合成出具有優(yōu)良物理化學(xué)和機(jī)械性能的聚羥基苯烷酸酯，利用它在降解過程中緩慢釋放出含苯基功能團(tuán)的有機(jī)酸如苯乙酸、苯丁酸等的特點，從而使生物可降解醫(yī)用材料聚羥基烷酸酯在使用過程中具有抗腫瘤、鎮(zhèn)痛等新的醫(yī)學(xué)作用，可為擴(kuò)大該類生物高分子材料在醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用奠定良好的基礎(chǔ)。

目前，關(guān)于利用發(fā)酵法合成聚羥基丁酸酯(PHB)的濃度可達(dá)到每升140克，合成的羥基丁酸和羥基戊酸共聚物的濃度能達(dá)到每升50～90克左右，國內(nèi)已經(jīng)實現(xiàn)了規(guī)?；笊a(chǎn)。但是利用微生物以含苯有機(jī)物(如苯戊酸、苯乳酸等)為碳源合成含有苯基功能團(tuán)的聚羥基烷酸酯時，由于通常微生物代謝含苯有機(jī)物的速率較低，而且有機(jī)物碳源對細(xì)胞生長有明顯抑制作用等原因，使得最終得到的細(xì)胞濃度(小于每升2克)和產(chǎn)物濃度(小于每升1克)都很低，失去了工業(yè)化大生產(chǎn)的前景。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種微生物代謝含苯有機(jī)物的速率較高，而且有機(jī)物碳源對細(xì)胞生長抑制作用小，從而使得最終得到的細(xì)胞濃度和產(chǎn)物濃度都較高的兩段流加式高密度發(fā)酵合成聚羥基苯烷酸酯的方法。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案為：兩段流加式高密度發(fā)酵合成聚羥基苯烷酸酯的方法，分兩階段完成，第一階段：首先在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入不大于0.3g/L的含苯有機(jī)物和5～20g/L的糖作為碳源，然后接入惡臭假單胞菌種子液于發(fā)酵培養(yǎng)基中后在發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，以1vvm的流量將無菌空氣連續(xù)通入攪拌釜式發(fā)酵罐內(nèi)，控制發(fā)酵罐的攪拌轉(zhuǎn)速為150～800轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵溫度30±2℃，溶解氧濃度高于20％(通過調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速使溶解氧濃度高于20％，以同溫同壓下空氣中的氧在發(fā)酵液中的飽和溶解度值為100％為參照)；并利用氨水調(diào)節(jié)pH為7.0±0.3(如果不用氨水而用氫氧化鈉溶液來調(diào)節(jié)pH值時，在發(fā)酵過程中需要補給一定量的氮源如硫酸銨，以保證發(fā)酵過程中微生物對氮的需求量)；發(fā)酵過程中利用在線信號(如溶氧濃度、pH、在線糖濃度分析儀等)判斷發(fā)酵過程中碳源(糖和苯戊酸等)的消耗量，適時流加碳源以保證微生物的生長所需碳源；

(2)第二階段：當(dāng)微生物細(xì)胞吸光密度達(dá)到30(600nm波長下的測量值)后，利用不含氮的堿性溶液來調(diào)節(jié)pH值，并停止補加氨水和其它含氮物質(zhì)，使發(fā)酵液中的氮含量逐漸降低至0.001mol/L，造成發(fā)酵液中氮源供給不足實現(xiàn)氮限制；同時，適當(dāng)降低發(fā)酵罐的攪拌轉(zhuǎn)速使發(fā)酵液中溶解氧濃度低于10％，使氧的供給速率小于細(xì)胞正常生長代謝所需值形成氧限制，從而同時實施氮限制和氧限制，并隨時監(jiān)控溶解氧濃度和pH值的變化，當(dāng)二者的值同時迅速上升時，流加碳源，微生物就會將發(fā)酵液中的碳源通過微生物代謝合成轉(zhuǎn)化為聚羥基苯烷酸酯。

上述兩個階段的發(fā)酵溫度和pH值都控制一樣?？偘l(fā)酵培養(yǎng)時間在表4中給出了，至于第一階段的發(fā)酵時間沒有明確給出，但要求微生物細(xì)胞吸光密度達(dá)到30后進(jìn)入第二階段，給出總發(fā)酵培養(yǎng)時間就可以了。

上述的發(fā)酵培養(yǎng)基組成和配比及微量元素溶液的組成見表1。

上述所述的含苯有機(jī)物為苯戊酸、苯乳酸。

上述所述的糖為葡萄糖、蔗糖等。

本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果如下：1.第一階段，在發(fā)酵過程中補給充足的各種微生物生長代謝所需要的營養(yǎng)物，并使發(fā)酵液中苯戊酸的濃度維持在很低值(小于等于0.3g/L)，這樣微生物可以充分生長，提高細(xì)胞濃度；同時低濃度的苯戊酸為微生物提供了一個適應(yīng)含苯戊酸發(fā)酵液的環(huán)境，以免第二階段流加苯戊酸時導(dǎo)致微生物生長代謝速率大幅度減緩。在第二階段，同時實施了氮限制和氧限制，可以更好地促進(jìn)微生物將碳源轉(zhuǎn)化為聚羥基苯烷酸酯。采用這一技術(shù)工藝，可以實現(xiàn)高密度發(fā)酵合成聚羥基苯烷酸酯的目的，最終發(fā)酵液中干細(xì)胞濃度可以達(dá)到35.3g/L，產(chǎn)物聚羥基苯烷酸酯的濃度達(dá)到12.3g/L，而且聚羥基苯烷酸酯的組成會隨著第一階段和第二階段補給碳源的配比的不同而不同。