[發明專利]鑒別香菇菌種241和241-4的分子特異性標記引物及檢測方法

無效

• 申請號: 200910154923.1
• 申請日: 2009-11-30
• 公開（公告）號: CN101712984A
• 公開（公告）日: 2010-05-26
• 發明（設計）人: 李海波;吳學謙;付立忠;魏海龍;吳慶其;賀亮;程俊文
• 申請（專利權）人: 浙江省林業科學研究院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;冷紅梅

1.一種鑒別香菇生產菌種241和241-4的分子特異性標記引物，所述引物 序列為：

上游引物：5′-GGTTCTGCTCCTTGTGACTG-3′

下游引物：5′-TCTGCTCTTCAGATGCAAGCT-3′。

2.一種利用權利要求1所述分子特異性標記引物對香菇生產菌種241和 241-4進行快速鑒別的方法，所述方法包括：提取待測香菇菌種基因組 DNA作為模板，以所述分子特異性標記引物作為擴增引物，進行PCR 擴增，對擴增產物進行電泳檢測，若電泳結果出現1609bp的DNA條 帶，則待測菌種為香菇241菌種，若電泳結果未出現1609bp的DNA 條帶，則待測菌種為香菇241-4菌種；所述分子特異性標記引物序列為：

上游引物5′-GGTTCTGCTCCTTGTGACTG-3′

下游引物5′-TCTGCTCTTCAGATGCAAGCT-3′。

3.如權利要求2所述的方法，其特征在于：

所述PCR擴增反應體系組成如下：

余量為ddH₂O；

PCR反應條件如下：

94℃預變性6min后；92℃變性40s，60℃退火40s，72℃延伸2min， 共30個循環；最后于72℃補平7min，終止溫度為4℃。

4.如權利要求2所述的方法，其特征在于所述方法如下：

(1)取待測香菇菌種，接種至PDA斜面培養基，25℃培養14d，轉接 至PD液體培養基中，25℃下振蕩培養14d，收集菌絲，以 SDS-CTAB法提取待測香菇菌種基因組DNA；

(2)以步驟(1)提取的基因組DNA為模板，以所述分子特異性標記 引物作為擴增引物，進行PCR擴增：

PCR反應體系每20μL組成如下：

ddH₂O補足至20μL；

PCR反應條件如下：

94℃預變性6min后；92℃變性40s，60℃退火40s，72℃延伸2min， 共30個循環；最后于72℃補平7min，終止溫度為4℃；

(3)取步驟(2)擴增產物5μL，與1μL?0.25％溴酚蘭緩沖液混勻， 點樣于1.5％的瓊脂糖凝膠上，于1×TAE緩沖液中、5V/cm電壓 下電泳，電泳結束后EB染色，于自動凝膠圖像分析儀上照相， 若電泳結果出現1609bp的DNA條帶，則待測菌種為香菇241菌 種，若電泳結果未出現1609bp的DNA條帶，則待測菌種為香菇 241-4菌種。

5.如權利要求4所述的方法，其特征在于所述EB染色為在含0.5μg/ml?EB 的水溶液中染色30分鐘。