[發明專利]鑒別香菇菌種241和241-4的分子特異性標記引物及檢測方法

無效

• 申請號: 200910154923.1
• 申請日: 2009-11-30
• 公開（公告）號: CN101712984A
• 公開（公告）日: 2010-05-26
• 發明（設計）人: 李海波;吳學謙;付立忠;魏海龍;吳慶其;賀亮;程俊文
• 申請（專利權）人: 浙江省林業科學研究院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;冷紅梅

(一)技術領域

本發明涉及一種可區別香菇生產近緣種241和241-4的分子特異性標 記引物，以及利用該引物對香菇生產菌種241和241-4進行區別和鑒定的 方法。

(二)背景技術

香菇Lentinula?edodes(Berk.)Pegler因其美味和具有重要的食、藥用 價值而倍受國內外消費者的喜愛，是我國商業化生產規模最大和世界上產 量僅次于雙孢蘑菇的食用菌。中國是最早栽培香菇的國家，目前香菇產量 達到全世界的70％。

香菇菌種是香菇生產中最重要的生產資料，目前在中國商業化栽培使 用的香菇菌種已超過100余種。不同的香菇菌種具有不同的生產性狀和商 業利用價值，因而菌種的快速準確鑒定對于香菇產業的發展至關重要。香 菇菌種鑒定的經典方法主要是通過對香菇菌絲、菌落和子實體形態的宏觀 現察、生長特性、生理生化反應以及不同菌株間發生的拮抗反應等。這些 方法由于易受環境因素和生理狀況的影響，對形態特征上差異較小的菌株 尤其是一些香菇近緣種例如241與241-4，Cr02與Cr04，申香2號、 申香4號與申香6號，939-9與939-6等難以實現快速準確的鑒別。

此外，由于香菇菌種本身具有無性繁殖的遺傳特性，使得在菌種市場 上同種異名，異種同名、假種、劣種現象普遍存在，再加上菌種質量的退 化現象，不僅極大地損害了香菇生產者和育種者的利益，也極大地影響了 我國食用菌產業的持續健康發展。因此，建立起一套科學可靠、快速便捷 的香菇菌種鑒定體系，不僅有利于我國香菇種質資源的發掘與利用，更好 地為選育具有我國自主知識產權的優良香菇菌種服務，而且也是規范現階 段混亂的香菇菌種市場、促進香菇產業持續健康發展的迫切需要。

分子生物學技術的快速發展，特別是分子標記和基因標記技術的建立 與成熟，為發展簡便、快速、準確的菌株鑒定技術提供了有效手段。SCAR (特征性片段擴增區域)標記是1993年由Paran和Michelmore在RAPD 基礎上提出的，它基于對特異RAPD片段的測序，根據兩端序列設計一 對18～24堿基的引物，在較高的退火溫度下進行特異擴增實現的，其專 一性引物的采用排除了隨機引物結合位點之間的競爭，因而它是一種十分 穩定的分子標記，在應用上具有迅速、簡便、低成本的特點。

(三)發明內容

本發明目的是提供一種可區別香菇生產近緣種241和241-4的分子特 異性標記引物，以及一種利用該引物對香菇生產菌種241和241-4進行快 速辨別的方法。

本發明采用的技術方案是：

一種鑒別香菇生產菌種241和241-4的分子特異性標記引物，所述引 物序列為：

上游引物：5′-GGTTCTGCTCCTTGTGACTG-3′

下游引物：5′-TCTGCTCTTCAGATGCAAGCT-3′

該引物對是采用PCR技術，經過大量篩選試驗，采用RAPD標記獲 得香菇241和241-4菌種的差異DNA片段，將該片段克隆測序，以得到 DNA序列為基礎設計特異性引物。以該引物對對香菇241和241-4菌種 進行PCR擴增，可從241菌種中獲得1609bp大小的特異性片段。

本發明還涉及一種利用所述分子特異性標記引物對香菇生產菌種 241和241-4進行快速鑒別的方法，所述方法包括：提取待測香菇菌種基 因組DNA作為模板，以所述分子特異性標記引物作為擴增引物，進行PCR 擴增，對擴增產物進行電泳檢測，若電泳結果出現1609bp的DNA條帶， 則待測菌種為香菇241菌種，若電泳結果未出現1609bp的DNA條帶， 則待測菌種為香菇241-4菌種；所述分子特異性標記引物序列為：

上游引物5′-GGTTCTGCTCCTTGTGACTG-3′

下游引物5′-TCTGCTCTTCAGATGCAAGCT-3′

所述方法關鍵在于擴增引物的選擇、DNA提取、PCR反應體系及反 應條件確定，以及電泳檢測，均可按照本領域常規方法進行。