[發(fā)明專利]一種牛乳嗜冷菌假單胞菌的PCR快速檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910154038.3
• 申請日: 2009-10-22
• 公開（公告）號: CN101798591A
• 公開（公告）日: 2010-08-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉士旺;尤玉如;肖功年;毛建衛(wèi);黃俊;吳元鋒
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江科技學(xué)院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N27/447;C12N15/10;C12R1/38
• 代理公司: 杭州浙科專利事務(wù)所 33213
• 代理人: 吳秉中

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于食品微生物的檢測方法，具體涉及一種牛乳中嗜冷菌假單胞菌的PCR快速檢測方法。?

背景技術(shù)

研究結(jié)果表明，鮮牛奶中含有在冷藏溫度下大量繁殖的嗜冷菌，這些菌通常引起奶與奶制品出現(xiàn)酸味、異味、變色、凝固、發(fā)粘等變質(zhì)現(xiàn)象。嗜冷菌種類繁多，在已經(jīng)了解的嗜冷菌中，細(xì)菌是最多的一類，有30多個屬，其中屬于革蘭氏陰性的假單胞菌屬(Pseudomonas)和革蘭氏陽性的芽孢桿菌屬(Bacillus)的較多。嗜冷菌在長期生物進(jìn)化過程中形成了一系列適應(yīng)低溫的機制。這些機制包括營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和轉(zhuǎn)運、DNA的復(fù)制合成、蛋白質(zhì)的合成、能量代謝、細(xì)胞的分裂等方面。嗜冷菌營養(yǎng)體對UHT熱處理很敏感，在UHT熱處理過程中將會失去活性，但嗜冷菌的芽孢卻是耐熱的。?

牛乳和乳制品最常見的風(fēng)味缺陷-水果味和酸敗味，是牛乳中含有的大量的嗜冷菌對牛乳中的組成成分作用后的產(chǎn)物。所有的這些風(fēng)味缺陷如酸敗味、奶酪味、苦味、酵母味和魚腥味等產(chǎn)生的原因都被研究過。嗜冷菌分泌的蛋白酶和脂酶作用于牛乳中的蛋白質(zhì)和脂肪而使其分解和被嗜冷菌吸收利用。嗜冷菌所分泌的熱穩(wěn)定的胞外酶在牛乳中含量很低時也能水解牛乳中的蛋白質(zhì)和脂肪，從而引起超高溫牛乳產(chǎn)生苦味和出現(xiàn)膠凝沉淀；也能引起乳制品產(chǎn)生臭味，同時對消毒乳質(zhì)量、干酪生產(chǎn)、酸奶質(zhì)量等均產(chǎn)生一定的影響。?

嗜冷菌污染是現(xiàn)代乳制品加工過程中最常見的問題，大多數(shù)嗜冷菌在貯存?時能產(chǎn)生耐熱的酶類，這些酶能耐受巴氏消毒甚至UHT處理，導(dǎo)致乳及乳制品風(fēng)味、品質(zhì)降低，保質(zhì)期縮短，甚至危及加工過程的順利進(jìn)行，從而影響產(chǎn)品的質(zhì)量及加工過程的順利進(jìn)行。開展嗜冷菌的快速檢測和鑒定技術(shù)，及時而有有針對性地采取相應(yīng)的措施，對提高乳制品品質(zhì)，延長保質(zhì)期，具有重要的意義，不同地區(qū)、和不同的奶牛飼養(yǎng)方法等對嗜冷菌種類和數(shù)量都具有一定的影響，因此無論何地，也無論何種飼養(yǎng)和管理方法，牛奶中或多或少都可能會有嗜冷菌污染，無非是嗜冷菌種類和數(shù)量上的差異。不同廠家以及不同的鑒定方法等對嗜冷菌種類和數(shù)量的鑒定和檢測具有一定的影響，即使同一地區(qū)，由于各種原因也會造成牛乳中嗜冷菌種類和數(shù)量才在一定的差異。?

要減少嗜冷菌的危害，早期對牛奶原料中嗜冷菌的檢測和控制是關(guān)鍵。但當(dāng)前國內(nèi)外尚無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，更沒有包括PCR在內(nèi)的快速檢測方法。迄今，嗜冷菌的檢驗大多采用傳統(tǒng)粗放的方法，即在5-7℃培養(yǎng)10d后計數(shù)。該方法的缺點是費時費力，對操作技術(shù)的要求高，在實際生產(chǎn)中存在嚴(yán)重滯后的問題，往往是尚未完成檢測，原料奶已是成品，有的或許已進(jìn)入市場。原因是乳制品為保鮮類產(chǎn)品。生產(chǎn)周期短，大多在10d以內(nèi)，巴氏殺菌奶則更短一般在2-3d內(nèi)。?

傳統(tǒng)的嗜冷菌的鑒定方法還包括形態(tài)觀察、培養(yǎng)特征觀察、需氧性試驗、淀粉水解試驗、各種糖發(fā)酵試驗、吲哚試驗等等系列的鑒定步驟，這些鑒定方法工作量大、試驗內(nèi)容繁多、時間長。?

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計提供一種簡單、靈敏、準(zhǔn)確且快速的牛乳嗜冷菌假單胞菌的PCR的檢測方法的技術(shù)方案。?

所述的一種牛乳嗜冷菌假單胞菌的PCR快速檢測方法，其特征在于包括以?下工藝步驟：?

1)牛乳嗜冷菌的篩選?

用接種環(huán)無菌操作從原料乳中取樣，在特異篩選培養(yǎng)基制成的平板上進(jìn)行劃線分離，在溫度30-37℃下培養(yǎng)15-25小時后，平板上生長的暗紅色菌落，即為待鑒定菌株，?

所述的特異篩選培養(yǎng)基配方為：酵母提取物1-3g/L、蛋白胨2-5g/L、葡萄糖0.5-1.5g/L、甲基紫0.0001-0.01g/L、氯化-2，3，5三苯基四氮唑0.01-0.1g/L、瓊脂15.0-20.0g/L，用蒸餾水定容至1L，并調(diào)pH為6.0，121℃滅菌20分鐘；?

2)提取牛乳嗜冷菌的基因組?

挑取待鑒定菌株的單菌落接入70mL的特異篩選培養(yǎng)基中，在溫度30-37℃，轉(zhuǎn)速100-200轉(zhuǎn)/分鐘的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)15-25小時后，收集菌株，并提取菌株的DNA；?

3)PCR擴增?

將菌株DNA進(jìn)行PCR擴增，PCR擴增體系為：含20mmol/L?Mg²⁺的10×Buffer2μL、2.5mmol/L的dNTPs1.5μL、0.25μmol/L的F1和F2引物各1μL、5U/μL的Taq?DNA聚合酶0.5μL、DNA模板2μL、雙蒸水或三蒸水12μL，?