[發明專利]一種牛乳嗜冷菌假單胞菌的PCR快速檢測方法

有效

• 申請號: 200910154038.3
• 申請日: 2009-10-22
• 公開（公告）號: CN101798591A
• 公開（公告）日: 2010-08-11
• 發明（設計）人: 劉士旺;尤玉如;肖功年;毛建衛;黃俊;吳元鋒
• 申請（專利權）人: 浙江科技學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N27/447;C12N15/10;C12R1/38
• 代理公司: 杭州浙科專利事務所 33213
• 代理人: 吳秉中

1.一種牛乳嗜冷菌假單胞菌的PCR快速檢測方法，其特征在于包括以下工 藝步驟：

1)牛乳嗜冷菌的篩選

用接種環無菌操作從原料乳中取樣，在特異篩選培養基制成的平板上進行 劃線分離，在溫度30-37℃下培養15-25小時后，平板上生長的暗紅色菌落，即 為待鑒定菌株，

所述的特異篩選培養基配方為：酵母提取物1-3g/L、蛋白胨2-5g/L、葡萄 糖0.5-1.5g/L、甲基紫0.0001-0.01g/L、氯化-2，3，5三苯基四氮唑 0.01-0.1g/L、瓊脂15.0-20.0g/L，用蒸餾水定容至1L，并調pH為6.0，121℃ 滅菌20分鐘；

2)提取牛乳嗜冷菌的基因組

挑取待鑒定菌株的單菌落接入70mL的特異篩選培養基中，在溫度30-37℃， 轉速100-200轉/分鐘的恒溫搖床中培養15-25小時后，收集菌株，并提取菌株 的DNA；

3)PCR擴增

將菌株DNA進行PCR擴增，PCR擴增體系為：含20mmol/L?Mg²⁺的 10×Buffer2μL、2.5mmol/L的dNTPs1.5μL、0.25μmol/L的F1和F2引物各 1μL、5U/μL的Taq?DNA聚合酶0.5μL、DNA模板2μL、雙蒸水或三蒸水12μL，

擴增條件控制為95℃變性3分鐘后進入PCR循環，循環條件為94℃30秒、 56℃30秒、72℃70秒，擴增35個循環后72℃延伸補足10分鐘，

所述的引物F1：5′-GAGGAAGGTGGGGATGACGT-3′，

所述的引物F2：5′-GCCAAGGCATCCACC-3′；

4)擴增產物進行電泳檢測

取3μL步驟3)得到的擴增產物與1μL濃度為0.02-0.05％的溴酚藍混合， 取混合液在含有0.5-1μg/mLEB溶液的0.8-1％瓊脂糖凝膠中進行電泳和顯色， 電泳條件為電壓60-80V，電流40-50mA，電泳液中含有0.5-1μg/mL的EB溶液， 電泳直至溴酚藍條帶移動到距凝膠前1.5-2cm為止；

5)結果判斷

若擴增后電泳檢測出1.5KB大小的擴增產物，即可鑒定該原料乳中的菌株為 嗜冷菌假單胞菌。

2.如權利要求1所述的一種牛乳嗜冷菌假單胞菌的PCR快速檢測方法，其 特征在于步驟1)中取樣平板劃線后，在32-35℃培養箱中培養17-23小時，所 述的特異篩選培養基配方為：酵母提取物1.5-2.5g/L、蛋白胨3-4g/L、葡萄糖 0.7-1.3g/L、甲基紫0.0005-0.005g/L、氯化-2，3，5三苯基四氮唑0.02-0.08g/L、 瓊脂15.0-20.0g/L。

3.如權利要求1所述的一種牛乳嗜冷菌假單胞菌的PCR快速檢測方法，其 特征在于步驟1)中所述的特異篩選培養基配方為：酵母提取物2.5g/L、蛋白 胨3.5g/L、葡萄糖1.0g/L、甲基紫0.001g/L、氯化-2，3，5三苯基四氮唑0.05g/L、 瓊脂15.0-20.0g/L。

4.如權利要求1所述的一種牛乳嗜冷菌假單胞菌的PCR快速檢測方法，其 特征在于步驟2)中培養條件為：溫度32-35℃，轉速120-170轉/分鐘的恒溫 搖床中培養17-23小時。