[發明專利]花生葉片DNA微量快速提取方法

有效

• 申請號: 200910152267.1
• 申請日: 2009-07-10
• 公開（公告）號: CN101586102A
• 公開（公告）日: 2009-11-25
• 發明（設計）人: 單世華;萬書波;李春娟;張廷婷;閆彩霞
• 申請（專利權）人: 山東省花生研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C07H21/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

發明領域

本發明涉及農業技術領域，尤其涉及一種花生葉片基因組DNA的提 取方法。

背景技術

花生是世界最重要的油料作物之一，在我國花生生產發展迅速，總產量 已經位居世界首位。花生種質基礎有限，抗病資源缺乏，同時花生生產也一 直受多種病蟲害的危害，導致產量和品質下降。進行花生遺傳改良，培育新 的抗蟲抗病品種具有重要意義。系統育種，雜交育種，誘變育種都不能有目 的創新，而基因工程技術育種可以任意選擇生產上的當家品種進行外源基因 的導入，達到目的性狀基因的轉移，可目標明確的達到種質改良的目的。

建立高效植株再生體系技術是植物基因工程的關鍵環節之一。花生組織 培養，國外從40年代開始研究，我國從70年代開始，已在花生營養和生殖 器官建立了多種成熟的再生體系，為花生分子育種和品種改良提供了可靠的 技術基礎。遺傳轉化技術通過將特定的外源基因引入到受體細胞，并使其定 向穩定地轉化從而超越物種的限制，實現基因的交流，產生具有特定性狀的 轉基因植物，是對傳統的植物育種方法的補充，也是進一步實現作物產量提 高、抗性增強和品質改善的最大希望所在。花生基因轉化的基本技術環節是 分離目的基因，構建重組載體，導入外植體受體，篩選獲得目的基因的抗性 后代。目前，花生遺傳轉化的常用方法有農桿菌介導的遺傳轉化法和基因槍 法。無論采用何種轉化方式，提取組織培養外植提基因組DNA，對轉化體 進行分子鑒定，從而篩選轉化體都是必需的途徑。而目前常用的分子鑒定方 式是將獲得的卡那霉素抗性植物先移栽，然后采用大量提取方法提取植物基 因組DNA。該提取方法存在鑒定效率低、周期長、成本高等缺點，而本技 術則可以彌補上述缺點，提早轉化體鑒定時間，加快轉化體鑒定速度，從而 顯著提高轉化體鑒定效率，尤其適合大批量組培苗轉化植物的篩選鑒定。

植物基因組DNA的提取和鑒定是進行植物生物技術試驗所必需的試驗內 容，高質量的植物基因組DNA對于后續試驗操作非常有利。花生是我國重 要的油料作物和經濟作物，花生基因組DNA的提取是花生生物技術試驗中 一項常規技術，由于花生體內含有較多的次生代謝物質，所以其基因組提取 相對比較困難。目前廣泛應用的技術方法多是利用CTAB、酚類法大量提取， 不僅對操作人員有害，而且由于樣品需要量較多，對所檢測植株也有不利影 響，尤其對較小的植株。本技術中的一種小量快速提取花生基因組DNA的 方法，利于開展普通的花生生物技術試驗，可直接用于PCR、限制性酶切以 及組培苗初期分子鑒定等分子生物學試驗操作。

花生基因組DNA的提取是花生生物技術試驗中一項常規技術，由于花 生體內含有較多的次生代謝物質，所以其基因組提取相對比較困難。目前廣 泛應用的技術方法多是利用CTAB、酚類法大量提取，不僅對操作人員有害， 而且由于樣品需要量較多，對所檢測植株也有不利影響。

發明內容

為解決常規植物基因組DNA提取周期長、成本高等缺點，針對花生外 源基因遺傳研究中轉化體的篩選鑒定，本專利提供一種快速、高效、簡便的 花生葉片基因組DNA提取方法，該方法包括如下步驟：

(1)將無菌花生葉片置于離心管中，滴入0.2～0.4mL液氮后將所述葉 片搗碎，加入0.2～0.3mL提取液并混合均勻；

(2)加入適量濃度為15％～25％的SDS(W/V)后輕緩搖動離心管，此 步驟的目的是使DNA發生斷裂。將所得產物進行溫育；

(3)加入適量的經預冷處理的醋酸鉀(KAc)緩沖液，混合均勻后進 行第一次離心分離；

(4)將所得上清液加入適量預冷的異丙醇，混合均勻后在冰凍條件下 放置15～25分鐘；

(5)將上一步驟所得上清液進行第二次離心分離以沉淀核酸，其中所 述第二次離心分離的條件與第一次相同；離心后用預冷5小時以上的乙醇漂 洗沉淀，漂洗后干燥沉淀，隨后用適量Tris-EDTA(TE)溶液干燥沉淀。

在本發明的一個實施方式中，步驟(1)中的所述無菌花生葉片的取用 量為0.1～0.2g。

在本發明的一個實施方式中，步驟(1)中所述液氮的用量為0.4～0.6mL。

在本發明的一個實施方式中，步驟(2)中所述提取液的加入量為 0.2～0.3mL。

在本發明的一個實施方式中，所述20％的SDS的量為0.02～0.06mL。優 選0.03～0.05mL，更優選0.04mL。