[發明專利]檢測銅綠假單胞菌重要耐藥基因的基因芯片及其試劑盒

無效

• 申請號: 200910152073.1
• 申請日: 2009-07-28
• 公開（公告）號: CN101967508A
• 公開（公告）日: 2011-02-09
• 發明（設計）人: 王磊;康海蔚;曹勃陽;馮露
• 申請（專利權）人: 天津生物芯片技術有限責任公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C40B40/06;C12R1/385
• 代理公司: 北京連和連知識產權代理有限公司 11278
• 代理人: 賀小明

技術領域

本發明涉及一種基因芯片及包含該芯片的檢測用試劑盒，尤其是涉及一種檢測銅綠假單胞菌重要耐藥基因的基因芯片及檢測用試劑盒。

背景技術

銅綠假單胞菌(Pseudomonas?aeruginosa)是革蘭氏陰性非發酵機會致病菌，其易于在外界生長繁殖，分布廣泛、耐藥性強、傳播途徑多樣，成為當今醫院感染最常見的病原菌之一。重癥監護區的感染10％與銅綠假單胞菌有關，銅綠假單胞菌引起的肺炎、敗血癥顯示很高的發病率與死亡率。近年來，銅綠假單胞菌對抗生素的耐藥率逐年增高，多重耐藥銅綠假單胞菌的檢出率也越來越高。

銅綠假單胞菌可通過獲得性抗性或內在抗性對抗生素產生耐藥性。其中獲得性抗性可通過質粒、整合子、轉座子等移動元件在在同種或不同種屬之間進行基因的水平轉移，從而導致細菌耐藥性的傳播。因此對獲得性耐藥菌株的監控對于控制耐藥基因傳播及預防傳染病大爆發有積極意義。

銅綠假單胞菌可獲得多種抗性基因，如β-內酰胺酶類基因(tem，shv，oxa，veb，imp，vim)，氨基糖苷修飾酶基因(aac，aad，aph)。前者可導致細菌對β-內酰胺類抗生素抗性，后者可導致細菌對氨基糖苷類抗生素抗性，而此二類抗生素都是目前臨床治療銅綠假單胞菌感染的主要藥物。據我國臨床檢測數據，銅綠假單胞菌常見的重要耐藥基因有tem，carb，oxa?group?I，oxa?groupII，imp，aac(3’)-I，aac(3’)-II，aac(6’)-Ib，aac(6’)-II，aadB等.

對各類抗生素耐藥基因進行檢測鑒定，能更準確地對細菌耐藥性進行監測并有助于合理選用抗菌藥物，提高耐藥菌感染的治愈率。

一般檢測耐藥性的方法有：藥敏試驗、Southern?blot，PCR，RT-PCR，基因芯片等方法。傳統的藥敏試驗耗時長(3天)，只能判斷出耐藥表型，無法檢測具體耐藥原理；普通PCR及RT-PCR特異性高，但檢測通量極其有限；Southern?blot操作步驟繁瑣；基因芯片基于PCR技術，但比PCR更特異靈敏，且具有快速、高通量的優點，十分適用于對多重耐藥菌進行相關耐藥基因的檢測。

德國的Weile?Jan等(DNA?microarray?for?genotyping?multidrug-resistantPseudomonas?aeruginosa?clinical?isolates，2007，Diagnostic?Microbiology?andInfectious?Disease)利用基因芯片對97株多重耐藥銅綠假單胞菌臨床分離株進行了基因分型，結果表明該基因芯片速度快(5h)，準確率高達87.8％)。但該芯片造價較高，每個樣品檢測成本約50美元，每個靶基因只設計了一個探針，容易產生假陽性。

目前，國內尚未有針對銅綠假單胞菌耐藥基因的檢測芯片的文獻報道或發明專利。

發明內容

為了提高檢測速度與精確性，降低成本，更加適于實際應用，本發明提供了一種針對銅綠假單胞菌中常見的重要耐藥基因的檢測芯片及其試劑盒。

本發明所述的基因芯片，包括固相載體和固定在該固相載體上的寡聚核苷酸探針，該寡聚核苷酸探針包含下述DNA片段中的至少一種：

1)從carb、tem、imp、oxa?groupI、oxa?groupII、aac(3’)-I、aac(3’)-II、aac(6’)-Ib、aac(6’)-II、aadB基因和細菌16S?rRNA基因中所選取的至少一種DNA片段；

2)從上述1)中選取的至少一種DNA片段的互補DNA片段。

本發明的優選實施例中，所述寡核苷酸探針具有SEQ?ID?NO：1-SEQ?IDNO：29所示的核苷酸序列，或不同于SEQ?ID?NO：1-SEQ?ID?NO：29所示的核苷酸序列但編碼的氨基酸序列與SEQ?ID?NO：1-SEQ?ID?NO：29所示核苷酸序列所編碼的氨基酸序列相同的序列，具體的優選序列及功能見表1。

本發明所述的基因芯片用于銅綠假單胞菌耐藥基因carb、tem、，imp、oxa?groupI、oxa?groupII、aadB、aac(3’)-I、aac(3’)-II、aac(6’)-Ib、aac(6’)-II中至少一種的檢測。

本發明還提供使用上述的基因芯片檢測耐藥基因的方法，其主要包含步驟：

1)根據銅綠假單胞菌的耐藥基因設計并制備出用于PCR擴增的引物；

2)制備待測樣品的基因組DNA，使用步驟1)中的引物，按一定濃度混合，對待測樣品基因組DNA進行PCR擴增并純化PCR產物，制得靶序列；