[發(fā)明專利]改良多聚核苷酸合成的方法和成分

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910151168.1
• 申請日: 2000-09-22
• 公開（公告）號: CN101649307A
• 公開（公告）日: 2010-02-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊淑偉
• 申請（專利權(quán)）人: 錦可貝基因技術(shù)公司
• 主分類號: C12N9/16
• 分類號: C12N9/16;C12N15/55;C12N15/63;C12N1/21;C12N1/15;C12N5/10;C12Q1/42;C12Q1/68;C12R1/19
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利代理有限公司
• 代理人: 劉宇峰

本申請是申請?zhí)枮?0815973.4、申請日為2000年9月22日、發(fā)明名稱為“改良多聚核苷酸合成的方法和成分”的發(fā)明專利申請的分案申請。?

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及熱穩(wěn)定3′多聚核苷酸磷酸酶及它作為標(biāo)記蛋白，同時(shí)還涉及用一個(gè)基團(tuán)保護(hù)寡核苷酸引物的3′末端，以及提高從各種樣品中擴(kuò)增和分析DNA/RNA的靈敏度和特異性的方法。該發(fā)明能廣泛應(yīng)用于包括醫(yī)學(xué)遺傳研究、診斷，病原體檢測，法醫(yī)及動(dòng)植物遺傳應(yīng)用等各種樣品中進(jìn)行DNA/RNA擴(kuò)增和分析。?

技術(shù)背景

多聚核苷酸合成是一個(gè)信息轉(zhuǎn)移的過程，通常需要以其它多聚核苷酸分子作為模板。一般來說，模板依賴的多聚核苷酸合成包括多聚核苷酸模板分子的變性，引物分子的配對及在聚合酶作用下，核糖核苷-5′三磷酸在引物3′末端的延伸。該過程常在體外重復(fù)多次，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。?

盡管這種信息轉(zhuǎn)移的過程非常準(zhǔn)確，但在信息轉(zhuǎn)移的過程中涉及的生物分子機(jī)制沒有錯(cuò)誤校正。這些錯(cuò)誤在自然界中是突變的來源，而在體外反應(yīng)，如PCR、隨機(jī)引物標(biāo)記、DNA測序和逆轉(zhuǎn)錄中則會引進(jìn)顯著的失真。引物結(jié)合到非同源的位點(diǎn)(錯(cuò)配)，鏈延伸過程中在多聚核苷酸酶作用下的錯(cuò)誤配對都會引起錯(cuò)誤。?

各種熱穩(wěn)定DNA聚合酶在高至95℃仍保持穩(wěn)定，如從熱穩(wěn)定細(xì)菌Thermusaquaticus中分離的Taq?DNA和從古細(xì)菌Pyrococcus?furiosus分離得到Pfu?DNA聚合酶，減少了錯(cuò)配，從而提高了PCR反應(yīng)的靈敏度和特異性。?

從Thermus?thermophilus分離得到的熱穩(wěn)定Tth聚合酶可具有反轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶的活性(Myers?and?Gelfand，Biochemistry?30：7662-7666(1991))，克服了嗜溫性濾過性毒菌反轉(zhuǎn)錄酶只能在低溫下起作用及低溫下不能“讀”RNA模板的二級結(jié)構(gòu)的限制。在反轉(zhuǎn)錄過程中，可用Tth聚合酶在較高溫度進(jìn)行，從而剔除RNA的二級結(jié)構(gòu)，使合成全長cDNA成為可能。?

在多數(shù)的PCR反應(yīng)中，引物應(yīng)該特異性地結(jié)合在目標(biāo)序列。從而只有在溫度較高時(shí)引物才能特異性結(jié)合，但在某一PCR反應(yīng)階段中，尤其是在達(dá)到PCR所需的溫度前將各組分混合，混合物必定經(jīng)歷較低的溫度(如室溫)，在較低溫度下，引物會與非目的序列配對，或反應(yīng)混合物中的其它引物分子結(jié)合，產(chǎn)生非特異性延伸產(chǎn)物和引物二聚體，干擾來自于目的核酸的特異性產(chǎn)物。這些副產(chǎn)物會導(dǎo)致較高的背景，降低擴(kuò)增的效率和反應(yīng)的特異性。?

盡管PCR技術(shù)新近取得了進(jìn)步，但仍存在高背景的DNA錯(cuò)配和引物寡聚化的問題。尤其在應(yīng)用PCR技術(shù)進(jìn)行診斷時(shí)，目標(biāo)DNA只有少數(shù)的幾個(gè)挎貝(Chouet?al.Nucleic?Acid?Res.20：1717-1723(1992))。已知由DNA聚合酶由引起非特異性鏈延伸通常發(fā)生在熱循環(huán)開始前，所有反應(yīng)物在室溫下混合，從而導(dǎo)致非目的假的擴(kuò)增產(chǎn)物。?

目前，報(bào)道有三種方法可減少這些副反應(yīng)。第一個(gè)方法，叫“熱啟動(dòng)”PCR，有各種變化形式(Chou?et?al.Nucleic?Acid?Res.20：1717-1723(1992))；D′Aquila?et?al.Nucleic?Acid?Res.19：3749(1991))，其共同特點(diǎn)是所有其它試劑加熱到72℃后，才加入最后一種試劑，通常為聚合酶，這樣起到防止引物錯(cuò)配和寡聚化的作用。雖然這種方法確實(shí)能提高特異性，減少副產(chǎn)物，但在進(jìn)行大批量樣品時(shí)則極不方便，反應(yīng)混合物變得極容易污染及容易出錯(cuò)。?

第二種方法(Taq啟動(dòng))，在完全反應(yīng)混合物中加入聚合酶的抗體與聚合酶結(jié)合，如：可把商品名為“TaqStart”Taq?DNA聚合酶抗體預(yù)先與Taq?DNA聚合酶結(jié)合。該抗體能在室溫下抑制聚合酶活性(Kellogg?et?al.Biotechniques16：1134-1137(1994))，一旦反應(yīng)進(jìn)入熱循環(huán)，抗體就會因熱變性而失活，釋放出活性DNA聚合酶。但是用該方法來減少非目的序列的缺點(diǎn)是Taq?DNA聚合酶抗體必須存放在-20℃直到使用，即試劑盒必須在控制的溫度下包裝和運(yùn)送，從而提高了成本。同時(shí)，每個(gè)PCR反應(yīng)需要數(shù)量不少的抗體(大約1微克抗體/5UTaq)。同時(shí)，PCR產(chǎn)物中的抗體干擾PCR產(chǎn)物的進(jìn)一步免疫化學(xué)分析，如ELISA。?