[發明專利]用于高通量定量mRNA的裂解緩沖液、裂解細胞的方法和確定白細胞特異性mRNA精確量的方法

有效

• 申請號: 200910149382.3
• 申請日: 2004-10-29
• 公開（公告）號: CN101696409A
• 公開（公告）日: 2010-04-21
• 發明（設計）人: 三橋將人
• 申請（專利權）人: 日立化成工業株式會社;日立化成研究中心公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 北京銀龍知識產權代理有限公司 11243
• 代理人: 鐘晶

1.一種用于高通量定量mRNA的裂解緩沖液，包括：

(a)裂解細胞質膜的去污劑，所述去污劑選自由N-月桂酰肌氨酸、十 二烷基硫酸鈉、脫氧膽酸鈉、十六烷基三甲基溴化銨、IGEPAL?CA-630、N- 癸?；?N-甲基葡糖胺、辛基-β-D-吡喃型葡萄糖苷及它們的組合所組成的組 中，其中所述去污劑的濃度為0.05～2％；

(b)充分濃度的NaCl，其嚴格程度不超過4×SSC；

(c)將pH維持在7.0～8.0的范圍內的緩沖液，其包括1mM～100mM?Tris HCl；

(d)1.4～1.75M硫氰酸胍；以及

(e)200μg/ml～20mg/ml蛋白酶K。

2.根據權利要求1所述的裂解緩沖液，其中所述去污劑為多種去污劑。

3.根據權利要求1所述的裂解緩沖液，其中所述去污劑為0.1～2％ IGEPAL?CA-630。

4.根據權利要求1所述的裂解緩沖液，其中所述去污劑為0.05～2％N- 月桂酰肌氨酸。

5.根據權利要求1所述的裂解緩沖液，其中所述裂解緩沖液的pH維持 在7.4～8.0范圍內。

6.根據權利要求5所述的裂解緩沖液，其中所述緩沖液為1mM～100mM Tris?HCl。

7.根據權利要求1所述的裂解緩沖液，其中所述(d)為1.6M～1.7M硫 氰酸胍。

8.根據權利要求1所述的裂解緩沖液，其中所述(e)為 200μg/ml～1.0mg/ml蛋白酶K。

9.根據權利要求1所述的裂解緩沖液，其中所述(e)為 200μg/ml～500μg/ml蛋白酶K。

10.根據權利要求1所述的裂解緩沖液，進一步包括0.1～5mM?EDTA以 螯合Mg²⁺和Ca²⁺。

11.根據權利要求1所述的裂解緩沖液，進一步包括0.1～10％2-巰基乙醇。

12.根據權利要求1所述的裂解緩沖液，進一步包括DNA。

13.根據權利要求12所述的裂解緩沖液，其中所述DNA為10mg/ml超 聲降解的鮭魚精子DNA。

14.根據權利要求1所述的裂解緩沖液，進一步包括tRNA。

15.根據權利要求14所述的裂解緩沖液，其中所述tRNA為10mg/ml大 腸桿菌tRNA。

16.根據權利要求1所述的裂解緩沖液，進一步包括摻標對照RNA。

17.根據權利要求16所述的裂解緩沖液，其中所述摻標對照RNA選自 序列SEQ?ID?NO?2、SEQ?ID?NO?4和bcr-abl?RNA。

18.根據權利要求16所述的裂解緩沖液，其中所述摻標對照RNA為多 聚(A)⁺RNA。

19.根據權利要求1所述的裂解緩沖液，進一步包括特異性反義引物。

20.一種裂解細胞的方法，包括將細胞暴露于權利要求1-19中任意一項 所述的裂解緩沖液。

21.一種確定每μL全血中白細胞特異性mRNA精確量的方法，包括將 細胞暴露于權利要求1-19中任意一項所述的裂解緩沖液。