[發明專利]臨床治療用臍帶間充質干細胞的制備和儲存

無效

• 申請號: 200910147866.4
• 申請日: 2009-06-16
• 公開（公告）號: CN101591644A
• 公開（公告）日: 2009-12-02
• 發明（設計）人: 王福生;施明;徐若男
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三○二醫院
• 主分類號: C12N5/08
• 分類號: C12N5/08
• 代理公司: 北京華科聯合專利事務所
• 代理人: 王 為

技術領域

本發明涉及一種醫療用品的制備，具體是應用于臨床治療用的人臍帶間充質干細胞的制備和儲存。

技術背景

間充質干細胞(mesenchymal?stem?cells，MSCs)是干細胞的一種類型，因能分化為間質組織而得名，是屬于中胚層的一類多能干細胞，具有很強的自我更新和向多種組織分化發育的潛能。MSCs主要存在于結締組織和器官間質中，以骨髓中含量最為豐富，可以向多種中胚層和神經外胚層來源的組織細胞分化，如可分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肌腱細胞、平滑肌細胞、骨髓基質細胞、成纖維細胞及多種血管內皮細胞，甚至神經系統的神經元和神經膠質細胞，同時還具有免疫調節和促進造血重建等功能，使之成為治療多系統疾病的“實用型干細胞”。MSCs的多分化潛能和組織修復功能，使其在臨床上具備廣泛的應用潛能。目前，國內外已將MSCs應用于臨床治療移植物抗宿主病(GVHD)、心血管修復、脊髓損傷、骨和軟骨修復、燒傷、類風濕性關節炎、帕金森病等。人們正在繼續開發應用MSCs治療其他疾病的嘗試，相信，未來將有更多的疾病可以用MSCs進行治療。

目前MSCs還是主要來源于成人的骨髓。雖然骨髓的MSCs最為豐富，但成人骨髓來源的MSCs數量及增殖分化潛能隨年齡的增長而下降，且供者MSCs的采集須行骨髓穿刺術，手術存在一定的風險，異體間移植還增加了交叉感染的機會，自體骨髓MSCs移植，由于疾病的原因，病人常有感染及體質較弱等因素，也限制了其應用。而臍帶來源的MSCs增殖、分化能力強，適合體外大規模培養，且臍帶來源廣泛，便于取材，對供者無不利影響，無道德倫理的限制，同時臍帶來源的MSCs免疫原性低，異體間移植不會引起排斥反應，因此，臍帶MSCs有望成為骨髓MSCs的理想替代來源。

常用的臍帶間充質干細胞體外分離方法主要是酶解法，依據選取消化酶的種類又可分為膠原酶消化、胰酶消化和兩種酶順序消化法。由于酶解法需要應用動物蛋白源性的消化酶，存在過敏和交叉感染的可能，增加了臨床應用的安全風險。此外，應用酶解法成本較高，原代培養細胞純度低。為了克服以上缺點，本發明采用了植塊培養的方法，無需應用消化酶，有利于質量控制，且對細胞損傷小，細胞增殖能力強，原代培養細胞純度高，為臨床MSCs的應用提供了安全、可靠、充足的MSCs的來源，具有廣闊的應用前景。

發明內容

本發明目的在于提供一種以臍帶為來源的間充質干細胞的制備方法，克服了之前應用膠原酶和胰蛋白酶等異源蛋白消化法可能帶來的風險，降低制備成本，增加間充質干細胞的得率和安全性。

本發明的人臍帶間充質干細胞的制備方法如下：

1.無菌條件下取正常順產或剖腹產者胎兒臍帶，用含2％慶大霉素的生理鹽水反復沖洗，去除殘留血跡。同時進行病原微生物檢測，完全合格后，進行以下步驟。

2.將臍帶置于含2％慶大霉素的生理鹽水中，用無菌剪刀將其剪切至顆粒狀，收集組織塊置于50ml離心管內，高速離心，離心機轉速為2000轉/分鐘，離心10分鐘，棄掉上清，重新加入含2％慶大霉素的生理鹽水，將沉淀的組織塊充分振蕩，使之松散，高速離心，離心機轉速為2000轉/分鐘，離心10分鐘。

3.將步驟2所獲的組織塊用含10％胎牛血清的DMEM培養基內懸浮，充分振蕩后高速離心，離心機轉速為2000轉/分鐘，離心10分鐘，該步驟用以去除大量組織塊黏液。

4.將步驟3獲得的組織塊沉淀均勻種植于塑料細胞培養瓶中，置于5％CO₂培養箱中，待組織塊完全貼壁后，補加含10％胎牛血清的DMEM培養基。

5.于培養第10天左右在倒置顯微鏡下觀察到組織塊周圍出現貼壁、梭型或多角型細胞時，將組織塊全部吸出，補加含10％胎牛血清的DMEM培養基，置于5％CO₂培養箱中繼續培養。此后1周細胞增長迅速，成為形態較為均一的長梭型細胞，呈渦旋狀生長，貼壁細胞的融合率可達到80％。

6.待細胞80％融合，用0.25％胰酶消化，按1∶3傳代。

7.經14～15天擴增后，細胞傳至4～5代，可獲得大量間充質干細胞。細胞形態如圖1所示。

8.將步驟7擴增后獲得進行病原生物檢測，同時進行表型檢測，表型結果如圖2所示，符合CD31、HLA-DR、CD34和CD45陰性，CD44、CD73、CD90和CD105陽性的細胞，屬于合格細胞，將其加入凍存液后置于液氮中保存，液氮冷凍溫度為-196℃。記錄臍帶來源信息、細胞代數、細胞數量以及制備日期，即得。此臍帶間充質干細胞可用于臨床治療。