[發明專利]臨床治療用臍帶間充質干細胞的制備和儲存

無效

• 申請號: 200910147866.4
• 申請日: 2009-06-16
• 公開（公告）號: CN101591644A
• 公開（公告）日: 2009-12-02
• 發明（設計）人: 王福生;施明;徐若男
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三○二醫院
• 主分類號: C12N5/08
• 分類號: C12N5/08
• 代理公司: 北京華科聯合專利事務所
• 代理人: 王 為

1.一種臍帶間充質干細胞的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)無菌條件下取正常順產或剖腹產者胎兒臍帶，用含2％慶大霉素的生理鹽水反復沖洗，去除殘留血跡；

(2)將臍帶置于含2％慶大霉素的生理鹽水中，用無菌剪刀將其剪切至約顆粒狀，組織塊置于50ml離心管內，高速離心，離心機轉速為2000轉/分鐘，離心10分鐘，棄掉上清，重新加入含2％慶大霉素的生理鹽水，將沉淀的組織塊充分振蕩，使之松散，高速離心，離心機轉速為2000轉/分鐘，離心10分鐘；

(3)將步驟2所獲的組織塊用含10％胎牛血清的DMEM培養基懸浮，充分振蕩后高速離心，離心機轉速為2000轉/分鐘，離心10分鐘；

(4)將步驟3獲得的組織塊沉淀均勻種植于塑料細胞培養瓶中，置于5％CO₂培養箱中，待組織塊完全貼壁后，補加含10％胎牛血清的DMEM培養基；

(5)于培養第10天在倒置顯微鏡下觀察到組織塊周圍出現貼壁、梭型或多角型細胞時，將組織塊全部吸出，補加含10％胎牛血清的DMEM培養基，置于5％CO₂培養箱中繼續培養1周；

(6)待細胞80％融合，用0.25％胰酶消化，按1∶3傳代；

(7)經14～15天擴增后，細胞傳至4～5代，得到間充質干細胞。

2.權利要求1的制備方法，其特征在于，所述步驟進一步包括，將步驟7獲得的間充質干細胞進行病原生物檢測，同時進行細胞表型檢測，合格后加入凍存液后置于液氮中保存，液氮冷凍溫度為-196℃，記錄臍帶來源信息、細胞代數、細胞數量以及制備日期，即得合格的間充質干細胞。

3、權利要求1的制備方法，其特征在于，操作均在嚴格無菌條件下進行，使用的細胞培養基中加入0.2％的慶大霉素。

4、權利要求1的制備方法，其特征在于，步驟如下：

1)無菌條件下取正常順產的胎兒臍帶，臍帶長約20cm，用含2％慶大霉素的生理鹽水反復沖洗，去除殘留血跡，同時進行病原微生物檢測，完全合格后，進行以下步驟，

2)將臍帶置于含2％慶大霉素的生理鹽水中，用無菌剪刀將其剪切至顆粒狀，收集組織塊置于50ml離心管內，高速離心，離心機轉速為2000轉/分鐘，離心10分鐘，棄掉上清，重新加入含2％慶大霉素的生理鹽水，將沉淀的組織塊充分振蕩，使之松散，高速離心，離心機轉速為2000轉/分鐘，離心10分鐘，

3)將步驟2所獲的組織塊用含10％胎牛血清的DMEM培養基內懸浮，充分振蕩后高速離心，離心機轉速為2000轉/分鐘，離心10分鐘，去除大量組織塊黏液，

4)將步驟3獲得的組織塊沉淀均勻種植于塑料塑料細胞培養瓶中，置于5％CO₂培養箱中，待組織塊完全貼壁后，補加含10％胎牛血清的DMEM培養基，

5)于培養第10天在倒置顯微鏡下觀察到組織塊周圍出現貼壁、梭型或多角型細胞，將組織塊全部吸出，補加含10％胎牛血清的DMEM培養基，置于5％CO₂培養箱中繼續培養，

6)1周后待細胞80％融合，用0.25％胰酶消化，按1∶3傳代，

7)經15天擴增后，細胞傳至5代，獲得1×10⁸MSCs，

8)將步驟7擴增后獲得進行病原生物檢測，同時進行細胞表型檢測，合格后加入凍存液后置于液氮中保存，液氮冷凍溫度為-196℃，記錄臍帶來源信息、細胞代數、細胞數量以及制備日期。

5、權利要求1的制備方法，其特征在于，步驟如下：

1)無菌條件下取剖腹產的胎兒臍帶，臍帶長約25cm，用含2％慶大霉素的生理鹽水反復沖洗，去除殘留血跡，同時進行病原微生物檢測，完全合格后，進行以下步驟，

2)將臍帶置于含2％慶大霉素的生理鹽水中，用無菌剪刀將其剪切至顆粒狀，收集組織塊置于50ml離心管內，高速離心，離心機轉速為2000轉/分鐘，離心10分鐘，棄掉上清，重新加入含2％慶大霉素的生理鹽水，將沉淀的組織塊充分振蕩，使之松散，高速離心，離心機轉速為2000轉/分鐘，離心10分鐘，

3)將步驟2所獲的組織塊用含10％胎牛血清的DMEM培養基內懸浮，充分振蕩后高速離心，離心機轉速為2000轉/分鐘，離心10分鐘，去除大量組織塊黏液，

4)將步驟3獲得的組織塊沉淀均勻種植于塑料細胞培養瓶中，置于5％CO₂培養箱中，待組織塊完全貼壁后，補加含10％胎牛血清的DMEM培養基，

5)于培養第10天在倒置顯微鏡下觀察到組織塊周圍出現貼壁、梭型或多角型細胞，將組織塊全部吸出，補加含10％胎牛血清的DMEM培養基，置于5％CO₂培養箱中繼續培養，

6)1周后待細胞80％融合，用0.25％胰酶消化，按1∶3傳代，

7)經傳至15代，獲得4×10⁹MSCs，

8)將步驟7擴增后獲得進行病原生物檢測，同時進行細胞表型檢測，合格后加入凍存液后置于液氮中保存，液氮冷凍溫度為-196℃，記錄臍帶來源信息、細胞代數、細胞數量以及制備日期。