[發明專利]一種發酵液中他克莫司的分離純化方法

有效

• 申請號: 200910146385.1
• 申請日: 2009-06-22
• 公開（公告）號: CN101712686A
• 公開（公告）日: 2010-05-26
• 發明（設計）人: 劉忠
• 申請（專利權）人: 魯南制藥集團股份有限公司
• 主分類號: C07D498/18
• 分類號: C07D498/18;A61P31/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于生物醫藥技術領域，具體涉及一種大環內酯類強效免疫抑制劑他克莫司的 分離純化方法。

背景技術

他克莫司(Tacrolimus)又名FK-506，是由日本藤澤制藥公司于1984年從土壤放線 菌中提取的一種大環內酯類抗生素，為一種強力的新型免疫抑制劑，主要通過抑制白介素 -2(IL-2)的釋放，全面抑制T淋巴細胞的作用，較常用的環孢素(CsA)強100倍，因此大大 降低了臨床使用劑量和原治療費用。近年來，作為肝、腎等移植的一線用藥，已在日本、 美國等14個國家上市。

此外用本品的患者，細菌和病毒感染率也較環孢菌素治療者低，尤其是該藥品有較強 的親肝性。FK-506和環孢菌素合用具有明顯的協同作用，效果更好。他克莫司不僅可用 于防止免疫反應的發生，還可用于治療已發生的免疫反應及自身免疫性疾病，對防止器官 移植的免疫反應和自身免疫性疾病的治療具有重要意義。

目前，他克莫司的主要生產方法是發酵。從發酵液中分離純化他克莫司的方法，主要 是專利U.S.6,576,135，U.S.7,220,357，和WO/2006/031664，這些專利報道了用不同方 法分離純化他克莫司，但提取收率不是很高，導致工業化生產成本很高，產品的價格昂貴。

本發明的目的就是提供一種從發酵液中分離純化他克莫司的方法。主要涉及有機溶劑 浸提、大孔吸附樹脂和硅膠層析、重結晶等技術從鏈霉菌(CGMCC?No.2919)發酵液中分離 純化他克莫司的方法。

一般在他克莫司的初始分離階段并不提倡使用如：硅膠、氧化鋁及C18等為填料的柱 層析。主要是因為樣品成分復雜，雜質含量高，部分吸附性很強的雜質會造成填料的不可 逆吸附，再生相當困難，導致填料報廢，從成本上分析并不經濟。C18柱價格昂貴，處理 量相對較小，若直接分離他克莫司并不實際。但大孔樹脂與硅膠、氧化鋁等填料相比，其 特點表現在：處理量大、再生容易、價格便宜。他克莫司具有多環結構，理論上易被帶苯 環的吸附劑吸附，而以苯乙烯-二乙烯苯為載體的大孔吸附樹脂可成為他克莫司的良好吸附 劑。

硅膠層析，是進一步分離純化他克莫司的有效方法，層析的關鍵在于洗脫劑的選擇， 合適的洗脫溶劑可得到高純度的產品，利于產物的結晶。本發明采用乙酸乙酯和正己烷、 丙酮和正己烷等不同比例的混合溶劑做洗脫劑，能夠很好的把他克莫司與其它雜質分開， 并且洗脫劑的沸點很低，后序回收處理簡單，適合工業化生產。

發明內容

本發明的目的是提供一種從發酵液中分離純化他克莫司的方法。該方法克服了他克莫 司現有的提取技術的不足，提高了他克莫司的收率，從而提供一種能夠工業化純化的工藝。

本發明主要是先采用大孔吸附樹脂除去大量的色素和其它一些雜質，然后用硅膠層析 進一步分離純化性質相近的物質。經過兩步柱層析后，不僅他克莫司純化收率大幅增加， 而且純度也相應的提高。

具體地，本發明所述的從發酵液中分離純化他克莫司的方法，主要包括如下步驟：

1)在發酵液中加入助濾劑進行攪拌，過濾收集菌體；

2)用有機溶劑浸提菌體，濾液減壓濃縮得濃縮物；

3)步驟2)濃縮物進行大孔吸附樹脂層析，梯度洗脫，收集洗脫液，濃縮；

4)步驟3)濃縮物加入有機溶劑萃取，萃取液抽濾，減壓濃縮至油狀物；取樣，HPLC 檢測，他克莫司純度85％-90％，純化回收率達75％-80％。

5)步驟4)油狀物進行硅膠柱層析，梯度洗脫，收集洗脫液，濃縮；

6)步驟5)濃縮物經有機溶劑溶解，重結晶，即得產品；取樣，HPLC檢測，他克莫司 純度達95％以上，回收率達70％-75％。

優選地，步驟1)所述助濾劑為硅藻土、珍珠巖或其混合物；

優選地，步驟1)所述攪拌時間為15-30分鐘；

優選地，步驟2)所述有機溶劑為甲醇、氯仿、乙酸丙酯、二氯甲烷、乙酸丁酯、乙 醇、正己烷、乙腈、丙酮或石油醚中的一種或多種的混合物溶劑；

優選地，步驟2)室溫浸提菌體3-4次，每次浸提時間1-4小時；

優選地，步驟2)在減壓條件下，濃縮回收有機溶劑，得到濃縮物；

優選地，步驟3)所述的大孔吸附樹脂為非極性大孔吸附樹脂X-5、D4020、HZ801、HZ803 或HZ818；