[發明專利]靶向EGFR的單鏈抗體-力達霉素融合蛋白ER(Fv-LDP)

無效

• 申請號: 200910140404.X
• 申請日: 2009-05-06
• 公開（公告）號: CN101538331A
• 公開（公告）日: 2009-09-23
• 發明（設計）人: 盛唯瑾;甄永蘇;苗慶芳;商悅;趙春燕;李毅
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院醫藥生物技術研究所
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70;C12P21/02;C07K1/13;A61K38/16;A61K47/48;A61P35/00;C12R1/19
• 代理公司: 北京華科聯合專利事務所
• 代理人: 楊 厚;王 為

技術領域：

本發明涉及一種融合蛋白ER(Fv-LDP)，具體來講，所說融合蛋白含有抗EGFR的單鏈抗體和力達霉素輔基蛋白的氨基酸序列；

本發明還涉及一種可以經過分子強化制備含有烯二炔類發色團(AE)的強化融合蛋白ER(Fv-LDP-AE)；

本發明還涉及所說融合蛋白及其強化融合蛋白在腫瘤靶向治療中的應用。

背景技術：

表皮生長因子受體(epidermal?growth?factor?receptor，EGFR)是一種存在于細胞膜上的多功能糖蛋白，又稱HER1或ErbB-1。EGFR及其配體是細胞信號傳導系統的一部分，其信號傳導網絡在腫瘤的形成和發展過程中占了重要的地位。EGFR在包括頭頸部鱗狀細胞癌、乳腺癌、肺癌、成膠質細胞瘤、膀胱癌、直腸癌、卵巢癌和前列腺癌等多種類型的人類腫瘤中都存在著過度表達的情況。EGFR基因拷貝數增加或者過度表達，均能促進正常細胞的轉化和惡性腫瘤的轉移，因此EGFR是腫瘤治療中一個很有前景的靶分子。

以EGFR為靶點的腫瘤治療策略包括：干擾受體信號的單克隆抗體(monoclonalantibodies，MAbs)；將MAbs做為放射性核素、毒素或前藥的載體；低分子量酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)干擾受體信號；反義寡核苷酸或核酶阻斷受體的翻譯；細胞內單鏈抗體阻止受體向細胞表面的轉運；靶向EGFR的DNA疫苗等。在這些策略中，MAbs和TKIs目前已經有相應的藥物應用于腫瘤的臨床治療。Cetuximab(西妥昔單抗)和Nimotuzumab(尼妥珠單抗)均為針對EGFR的單克隆抗體藥物，其分子構成均為完整的免疫球蛋白。

scFv是近年來備受關注的一種基因工程小分子抗體。scFv只包含抗體分子中與抗原結合部分，由抗體重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)經過一個彈性linker連接而成，其相對分子量僅為完整抗體的1/6。與完整抗體及Fab段相比，scFv具有對實體瘤組織穿透能力強、在非靶向組織中滯留時間短、血液清除快等優點。更重要的是，scFv可在細菌中表達，易于基因操作和基因工程大量生產，并可利用基因工程方法構建與其他效應分子連接形成融合蛋白。目前，以抗EGFR單抗為基礎，構建的融合蛋白有EGFR/CD3雙特異性抗體、單鏈抗體-綠膿桿菌外毒素等。但是，將抗EGFR的單鏈抗體與力達霉素連接成為抗腫瘤導向藥物的融合蛋白ER(Fv-LDP)及其強化融合蛋白ER(Fv-LDP-AE)，迄今為止尚未見有國內外的相關報道。

作為高活性的“彈頭”藥物力達霉素(lidamycin，LDM，又稱C1027)，是從我國湖北省潛江縣土壤中分離得到的一株球孢鏈霉菌Streptiomyces?globisporus?C1027(2007年4月3日保藏于CGMCC，菌種保藏號為：CGMCC?No.0704)產生的烯二炔類抗生素，體外實驗顯示出強烈的腫瘤細胞殺傷作用，它的分子由烯二炔發色團和輔基蛋白兩部分構成。發色團有強烈活性，但不穩定，由110個氨基酸殘基組成的輔基蛋白(LDP)，對發色團的穩定性起保護作用。力達霉素具有獨特的可拆分的分子結構特點，便于DNA重組以及分子強化；另一方面，LDP分子量只有10.5kDa，LDP與單鏈抗體制備的融合蛋白分子量只有40kDa左右，低于其它已知的基于抗體的融合蛋白。

本發明采用噬菌體抗體庫技術篩選EGFR高親和力scFv，從免疫小鼠的脾細胞中獲取抗體基因。由于scFv分子小，所以作為異種蛋白的免疫原性較?。挥糜谀[瘤治療時，因組織穿透能力強，較易進入實體瘤內部。本發明所說融合蛋白及其強化融合蛋白中的單鏈抗體靶點，是鱗狀上皮癌、肺癌、乳腺癌等腫瘤高表達的EGFR胞外段蛋白，不同于本實驗室先前以EGFR為靶點構建的多肽。單鏈抗體的親和力更高，靶向性更好。

本發明的目的之一是，在篩選EGFR高親和力單鏈抗體的基礎上，構建單鏈抗體與力達霉素輔基蛋白的融合蛋白ER(Fv-LDP)；

本發明的目的之二是，進一步用具有高活性的活化型烯二炔(AE)進行分子強化，構建強化融合蛋白ER(Fv-LDP-AE)；

本發明的目的之三是，以力達霉素為“彈頭藥物”，scFv為導向載體，制備可用于EGFR高表達腫瘤治療的高效、小型化抗體靶向藥物。

發明內容：

本發明所提供的融合蛋白ER(Fv-LDP)是由抗EGFR單鏈抗體scFv和力達霉素輔基蛋白LDP構成的，基因全長1089bp，編碼363個氨基酸；其強化融合蛋白ER(Fv-LDP-AE)是由融合蛋白以及活化型烯二炔發色團AE組裝而成，其制備方法為：