[發(fā)明專利]靶向EGFR的單鏈抗體-力達(dá)霉素融合蛋白ER(Fv-LDP)

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910140404.X
• 申請日: 2009-05-06
• 公開（公告）號: CN101538331A
• 公開（公告）日: 2009-09-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 盛唯瑾;甄永蘇;苗慶芳;商悅;趙春燕;李毅
• 申請（專利權(quán)）人: 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70;C12P21/02;C07K1/13;A61K38/16;A61K47/48;A61P35/00;C12R1/19
• 代理公司: 北京華科聯(lián)合專利事務(wù)所
• 代理人: 楊 厚;王 為

1、一種融合蛋白ER(Fv-LDP)，其特征是所說融合蛋白由抗EGFR單鏈抗體scFv、力達(dá)霉素輔基蛋白LDP和羧基端的組氨酸六聚體尾組成，基因全長1089bp，編碼363個(gè)氨基酸。

2、一種強(qiáng)化融合蛋白ER(Fv-LDP-AE)，其特征是所說強(qiáng)化融合蛋白由分子量為38kDa的融合蛋白ER(Fv-LDP)和分子量為843Da的活化型烯二炔發(fā)色團(tuán)AE構(gòu)成。

3、如權(quán)利要求1所述的融合蛋白ER(Fv-LDP)，其特征是其中scFv基因全長711bp，編碼237個(gè)氨基酸，LDP基因全長342bp，編碼114個(gè)氨基酸，二者之間的柔性肽基因長15bp，編碼5個(gè)氨基酸，羧基端的組氨酸六聚體尾基因長18bp，編碼6個(gè)氨基酸，終止密碼子3bp。

4、制備如權(quán)利要求1所述融合蛋白ER(Fv-LDP)的方法，其特征是所說方法主要采用噬菌體抗體庫篩選、DNA重組兩條技術(shù)路線，具體步驟如下：

A.噬菌體單鏈抗體庫的構(gòu)建；

B.抗EGFR噬菌體抗體的富集篩選及鑒定；

C.抗EGFR單鏈抗體scFv基因的擴(kuò)增；

D.融合蛋白大腸桿茵重組表達(dá)質(zhì)粒pET-Fv-LDP的構(gòu)建；

E.融合蛋白ER(Fv-LDP)在保藏編號為CGMCC?No.2977的大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)；

F.融合蛋白ER(Fv-LDP)的親和層析純化及分離。

5、如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征是運(yùn)用基因克隆技術(shù)將B細(xì)胞全套可變區(qū)基因克隆出來，用柔性肽基因?qū)H和VL基因拼裝成scFv基因；將scFv基因連接到噬菌粒pCANTAB?5E中，電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌，再用輔助噬菌體M13K07感染，獲得噬菌體單鏈抗體庫。

6、如權(quán)利要求4或5所述的制備方法，其特征是用純化的EGFR為靶抗原對噬菌體單鏈抗體庫進(jìn)行5輪富集篩選得到次級抗體庫，并鑒定陽性克隆。

7、如權(quán)利要求4或6所述的制備方法，其特征是運(yùn)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增得到在羧基端含有一段柔性小肽的抗EGFR單鏈抗體scFv基因，同時(shí)引入特異性酶切位點(diǎn)。

8、如權(quán)利要求4或7所述的制備方法，其特征是將所得到的抗EGFR單鏈抗體scFv基因克隆至重組質(zhì)粒pET-LDP中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-Fv-LDP。

9、如權(quán)利要求4或8所述的制備方法，其特征是將pET-Fv-LDP轉(zhuǎn)化至大腸桿菌宿主菌中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，獲得以包涵體形式表達(dá)的融合蛋白ER(Fv-LDP)，并進(jìn)行條件優(yōu)化獲得最佳表達(dá)。

10、如權(quán)利要求4或9所述的制備方法，其特征是通過親和層析純化融合蛋白ER(Fv-LDP)，濃縮凍干，制備功能性融合蛋白。

11、制備如權(quán)利要求2所述強(qiáng)化融合蛋白的方法，其特征是將純化分離得到的融合蛋白ER(Fv-LDP)與經(jīng)甲醇提取制備的力達(dá)霉素活性型烯二炔發(fā)色團(tuán)AE，按1∶3分子比進(jìn)行分子強(qiáng)化，獲得強(qiáng)化融合蛋白ER(Fv-LDP-AE)。

12、權(quán)利要求1所述融合蛋白ER(Fv-LDP)在制備抗EGFR高表達(dá)腫瘤新型抗體靶向藥物中的應(yīng)用。

13、權(quán)利要求2所述強(qiáng)化融合蛋白ER(Fv-LDP-AE)在制備抗EGFR高表達(dá)腫瘤新型抗體靶向藥物中的應(yīng)用。