[發(fā)明專(zhuān)利]朝鮮淫羊藿的分子鑒定方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910136663.5
• 申請(qǐng)日: 2009-05-12
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101886116A
• 公開(kāi)（公告）日: 2010-11-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王川易;郭寶林;肖培根
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

一.技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及中藥材來(lái)源品種鑒定技術(shù)領(lǐng)域，采用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定的分子方法。

二.背景技術(shù)：

中藥淫羊藿為來(lái)源于小檗科淫羊藿屬多個(gè)種植物的干燥地上部分，在我國(guó)有悠久的使用歷史。其功效除了傳統(tǒng)的補(bǔ)腎壯陽(yáng)祛風(fēng)濕之外，臨床上還被用于治療骨質(zhì)疏松、更年期綜合癥、高血壓、冠心病等疾病，另外淫羊藿還具有增強(qiáng)免疫力、抗衰老、抗腫瘤、抗艾滋病等作用，因此受到國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注。藥典規(guī)定藥材淫羊藿的來(lái)源物種包括：淫羊藿Epimedium?brevicornu?Maxim.、箭葉淫羊藿Epimedium?sagittatum(Sieb.et?Zucc.)Maxim.、柔毛淫羊藿Epimedium?pubscens?Maxim.、朝鮮淫羊藿Epimedium?koreanum?Nakai和巫山淫羊藿Epimediumwushanense?T.S.Ying等5個(gè)種；《貴州省中藥材、民族藥材標(biāo)準(zhǔn)》中還收載了粗毛淫羊藿Epimedium?acuminamm?Franch.、天平山淫羊藿Epimedium?myrianthum?Stearn、黔嶺淫羊藿Epimedium?leptorrhizum?Steam和氈毛淫羊藿Epimedium?coactum?H.R.Liang.，其來(lái)源之多在中藥中是很罕見(jiàn)的。不同植物來(lái)源的淫羊藿藥材其有效成分的含量存在很大的差異，再加上藥材和飲片難以進(jìn)行形態(tài)鑒別，這就對(duì)藥材質(zhì)量控制造成了很大的障礙，這就需要尋找到一種穩(wěn)定可靠的方法將不同來(lái)源的淫羊藿藥材和飲片加以鑒定區(qū)分。通過(guò)比較不同藥用淫羊藿品種的一段DNA堿基序列，找到了朝鮮淫羊藿和其他藥用淫羊藿品種存在差異的一段序列，這種差異可以通過(guò)進(jìn)行鑒定性PCR來(lái)區(qū)別。

三、發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種在藥用淫羊藿品種中準(zhǔn)確鑒定朝鮮淫羊藿的鑒定性PCR分子鑒定方法，該方法包括朝鮮淫羊藿的特征性DNA堿基序列、兩對(duì)鑒定性PCR引物及其鑒定方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：首先從各藥材中提取基因組DNA，然后利用該方法進(jìn)行鑒定。

本發(fā)明設(shè)計(jì)的朝鮮淫羊藿聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的鑒定引物DNA序列為：

引物1：kor.-aF：5’-CAGCGAACTTGTGAAAAACAC-3’

引物2：kor.-bR：5’-CGATAAGAGAACAAAGGGCTA-3’

引物3：kor.-bF：5’-CGAACTTGTGAAAAACAC-3’

用全自動(dòng)DNA合成儀按上述鑒定引物的DNA序列進(jìn)行合成，即得到鑒定引物的白色粉末結(jié)晶。

中藥材朝鮮淫羊藿聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)鑒定的方法為：

1、藥材DNA的提取：按照常規(guī)植物DNA的提取方法或者用市售植物基因組提取試劑盒進(jìn)行，用無(wú)菌去離子水溶解供試品DNA模版，并將模版濃度調(diào)整到能夠進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng)的濃度；

2、模版DNA質(zhì)量的鑒定：用另一對(duì)引物鑒別模版DNA的質(zhì)量，該對(duì)引物能夠擴(kuò)增淫羊藿屬植物的線(xiàn)粒體基因組nad1第2內(nèi)含子序列。引物的DNA序列為nad1-2intron-up：5’-GGT?CTT?ATT?CTT?ATT?GTG?CGC?CT-3’，nad1-2intron-low：5’-TTC?GTC?TAT?ACCAGA?CCA?TAA?GG-3’。反應(yīng)體系為：引物各01uM，10ul的2×PCR?StarMix，模版DNA約20ng，用無(wú)菌去離子水補(bǔ)充反應(yīng)體積到20ul。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸2min，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。取5ul的PCR產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠(包括適量的溴化乙錠，即EB)檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。如果得到1800bp左右的條帶，則表明DNA模版合格，可以進(jìn)行后續(xù)的鑒定試驗(yàn)，如果沒(méi)有陽(yáng)性條帶，則需要改進(jìn)DNA提取方法，以得到合格的模版DNA。對(duì)于模版DNA質(zhì)量的鑒定，也可以選擇其他能夠在淫羊藿屬植物中成功擴(kuò)增的引物對(duì)進(jìn)行；

3、鑒定性PCR反應(yīng)：引物用無(wú)菌去離子溶解并稀釋至2umol/uL。以25uL反應(yīng)體系為參照，各物品的用量為：

10×PCR反應(yīng)緩沖液???2.5ul

dNTPs(2.5mM)????????1.6ul

primer?1(2um)???????2ul

primer?2(2um)???????2ul

Easy?Taq(5U/ul)?????0.3ul

DNA模版?????????????20ng

ddH2O???????????????補(bǔ)充體積到25uL