[發明專利]朝鮮淫羊藿的分子鑒定方法

無效

• 申請號: 200910136663.5
• 申請日: 2009-05-12
• 公開（公告）號: CN101886116A
• 公開（公告）日: 2010-11-17
• 發明（設計）人: 王川易;郭寶林;肖培根
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院藥用植物研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種來源為朝鮮淫羊藿Epimedium?koreanum的中藥淫羊藿藥材聚合酶鏈式反應鑒定引物，其特征在于：

可分別用兩對鑒定引物kor.-aF&kor.-bR以及kor-bF&kor.-bR對朝鮮淫羊藿進行分子鑒定。鑒定引物DNA序列為kor.-aF：

5’-CAGCGAACTTGTGAAAAACAC-3’，kor.-bR：5’-

CGATAAGAGAACAAAGGGCTA-3’以及kor.-bF：5’-

CGAACTTGTGAAAAACAC-3’，用全自動DNA合成儀按上述鑒定引物的DNA序列進行合成，即得到鑒定引物的白色粉末結晶。

2.根據權利要求1所述鑒定引物鑒定朝鮮淫羊藿原植物以及來源于朝鮮淫羊藿的中藥淫羊藿藥材和飲片的方法，其特征在于朝鮮淫羊藿聚合酶鏈式反應(PCR)鑒定的步驟為：

(1)藥材DNA的提取：按照常規植物DNA的提取方法或者用市售植物基因組提取試劑盒進行，用無菌去離子水溶解共試品DNA模版，并將模版濃度調整到能夠進行常規PCR反應的濃度；

(2)模版DNA質量的鑒定：用另一對引物鑒別模版DNA的質量，該對引物能夠擴增淫羊藿屬植物的線粒體基因組nad1第2內含子序列。引物的DNA序列為nad1-2intron-up：5’-GGT?CTT?ATT?CTT?ATT?GTG?CGC?CT-3’，nad1-2intron-low：5’-TTC?GTC?TAT?ACC?AGA?CCA?TAA?GG-3’。反應體系為：引物各0.1uM，10ul的2×PCR?StarMix，模版DNA約20ng，用無菌去離子水補充反應體積到20ul。PCR擴增程序為：95℃預變性3min；94℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸2min，共30個循環；72℃延伸10min。取5ul的PCR產物在1％瓊脂糖凝膠(包括適量的溴化乙錠，即EB)檢測擴增結果。如果得到1800bp左右的條帶，則表明DNA模版合格，可以進行后續的鑒定試驗，如果沒有陽性條帶，則需要改進DNA提取方法，以得到合格的模版DNA，對于模版DNA質量的鑒定，也可以選擇其他能夠在淫羊藿屬植物中成功擴增的引物對進行；

(3)鑒定性PCR反應：引物用無菌去離子溶解并稀釋至2umol/uL。以25uL反應體系為參照，各物品的用量為：

10×PCR反應緩沖液????2.5ul

dNTPs(2.5mM)?????1.6ul

primer?1(2um)????2ul

primer?2(2um)????2ul

Easy?Taq(5U/ul)??0.3ul

DNA模版??????????20ng

ddH2O????????????補充體積到25uL

(4)PCR反應程序：在PCR儀上按照以下程序進行擴增反應

(5)電泳檢測：取5uLPCR反應液與1uL加樣緩沖液混合，1％瓊脂糖凝膠電泳(含0.5％溴化乙錠)檢測PCR擴增產物；

反應體系可以因為酶的活性、模版DNA的質量等原因進行調整；

檢測結果有陽性條帶，則檢測對象為朝鮮淫羊藿；如果是陰性結果，則檢測對象不是朝鮮淫羊藿。