[發明專利]一種用于基因治療的新型細胞特異性內含microRNA結合序列的基因HAAVmir

無效

• 申請號: 200910136134.5
• 申請日: 2009-04-30
• 公開（公告）號: CN101532024A
• 公開（公告）日: 2009-09-16
• 發明（設計）人: 許瑞安;肖衛東;陸暉
• 申請（專利權）人: 許瑞安;肖衛東;陸暉
• 主分類號: C12N15/33
• 分類號: C12N15/33;C12N15/34;C12N15/48;C12N15/86;C12N15/861;C12N15/867;A61K48/00;C12R1/93
• 代理公司: 北京華科聯合專利事務所
• 代理人: 楊 厚;王 為

技術領域：

本發明涉及基因治療領域，具體而言，涉及一種新型的、細胞靶向特異性的、從源頭徹底消除病毒衣殼蛋白復制與合成能力并清除其污染蛋白的基因片段及其在基礎和臨床醫學上應用。

背景技術：

目前基因治療臨床試驗用的載體仍然以病毒載體居多，占75％以上。其中，腺病毒(adenovirus)和逆轉錄病毒(retrovirus)載體占了大部分[許瑞安等，《分子基因藥物學》，北京大學出版社&北京大學醫學出版社，2008，北京]。病毒是在漫長的自然進化過程中存活下來的沒有細胞結構的最小、最簡單的生命寄生形式。在幾千年的自然進化過程中，它可以找到最有效的途徑進入人體。而病毒載體則利用了病毒天然的或改造的外殼和(或)外膜結構來裝載目的基因。由于病毒本身是一種病原體，故對人體構成一定的安全隱患。目前，雖然基因治療研究取得了可喜的進展，但仍有許多障礙有待克服，其中最主要的一個障礙是宿主對基因治療載體和/或轉基因產物產生的免疫反應。基因藥物既可能引起固有性免疫反應，又可能引發適應性免疫反應。免疫反應常常導致基因表達效率下降，治療不能持久，尤其再次使用相同載體時療效更差，甚至產生嚴重的毒副作用。因此，為了實現基因治療的長期療效，必須設法降低免疫反應，誘導免疫耐受性。

腺相關病毒或稱腺伴隨病毒(AAV)屬細小病毒科，為單鏈DNA，約4.7kb，能感染分裂期和非分裂期細胞，并能整合于宿主細胞染色體，可長期穩定表達。AAV的復制依賴于輔助病毒，如腺病毒或皰疹病毒等。AAV載體雖然不含病毒外殼蛋白基因，但病毒外殼蛋白可通過主要組織相容性復合體(MHC)II類途徑將抗原遞呈給CD4⁺T細胞。當其再次與機體接觸時可激活B細胞，產生針對AAV的特異性中和抗體，明顯抑制AAV載體介導的基因傳遞。如在免疫適能小鼠與恒河猴的實驗中發現，肌肉注射AAV2載體的外殼蛋白可激活Th2細胞及B細胞，產生AAV2特異性的IgM及IgG。AAV載體除了能誘導T細胞依賴性的B細胞反應外，還可誘導T細胞非依賴性的B細胞反應。研究發現，通過脾臟將AAV載體輸入到小鼠門脈循環可誘發部分T細胞非依賴性的B細胞反應，其持續時間比T細胞依賴性的B細胞反應要短。由AAV病毒外殼蛋白引起的體液免疫反應還與其使用劑量有關，降低載體劑量可大大減少體液免疫反應的產生。

最近的血友病基因治療臨床試驗表明，在通過肝動脈途徑給藥后，AAV2外殼啟動了CD8⁺T細胞介導的免疫反應，對轉導了載體的肝細胞產生細胞毒作用，從而使有效的第九因子(FIX)表達只持續了8周，導致治療失敗。研究人員認為，患者曾經感染過AAV2，并在機體存在有針對病毒的記憶性CD8+T細胞，在接受基因治療后，AAV2外殼激活了這些記憶性CD8+T細胞，導致含有AAV2載體的肝細胞被免疫系統清除[Halbert?Clet?al?J?Virol，1998.72(12)：p.9795-80]。

從靶組織內復制AAV顆粒(rcAAV)所合成的包裝蛋白殘余污染引發的危險性免疫反應長期存在，尤其在FIX表達對血友病臨床治療中，AAV顆粒(rcAAV)合成的包裝蛋白引發的危險性免疫反應一直被廣為關注。為了系統地減少含有潛在污染蛋白的rcAAV顆粒的影響，從源頭徹底消除病毒衣殼蛋白復制與合成能力的研究，迄今為止，尚未見有國內外的相關報道。

本發明的目的是設計構建一種新型的、細胞特異性的、內含多個組織特異如肝特異(has-mir-122)和造血特異(has-mir-142-3p)序列拷貝的microRNA結合序列的基因片段，籍以控制包裝蛋白基因片段表達，進而清除腺相關病毒包裝蛋白污染誘發的AAV載體介導的免疫反應，以確保基因治療能在臨床取得成功。

發明內容：

本發明提供了一種病毒復制基因、包裝蛋白基因和細胞特異靶向性microRNA序列組成的基因片段。其病毒復制基因，可以是AAV1型，AAV2型，AAV4型，AAV5，AAV8型，AAV9和其他類型AAV以及其他病毒的復制基因或非結構基因；其病毒包裝蛋白基因，可以是AAV病毒包裝蛋白基因，腺病毒包裝蛋白基因，慢病毒包裝蛋白基因或其它病毒包裝蛋白基因；其細胞特異靶向性microRNA序列，可以選自肝細胞靶向性、肺細胞靶向性、造血細胞靶向性，或其他細胞靶向性的microRNA。

本發明提供的基因片段可直接導入肝細胞株，干細胞株，肺細胞株，肌肉細胞株或其他細胞株，也可用于構建重組腺相關病毒質粒和載體，用于基礎研究和臨床基因治療。