[發明專利]檢測藏綿羊腐蹄病抗性等位基因的特異性擴增引物及其檢測試劑盒和檢測方法

無效

• 申請號: 200910134866.0
• 申請日: 2009-04-10
• 公開（公告）號: CN101532061A
• 公開（公告）日: 2009-09-16
• 發明（設計）人: 羅玉柱;胡江;劉秀;王繼卿;馬小軍
• 申請（專利權）人: 甘肅農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 蘭州振華專利代理有限責任公司
• 代理人: 張 真

技術領域：

本發明主要涉及動物生物技術領域中的綿羊分子標記輔助育種技術，具體涉及到藏 綿羊腐蹄病抗性等位基因的檢測。

背景技術：

綿羊腐蹄病是由節瘤擬桿菌引起高度接觸性傳染病，其特征是蹄局部組織發炎、壞 死。綿羊患病后生長不良、掉膘、羊毛品質下降，病情嚴重且得不到及時治療時會引起 羊只死亡。藏綿羊易患腐蹄病，于每年7-9月份的多雨季節爆發，如在甘肅和青海境內 的藏綿羊發病率高達30％以上，死亡率最高可達10％，嚴重影響牧區養羊業發展。

動物主要組織相容性(基因)復合體(major?histocompatibility?complex，MHC)與多 種疾病有密切關系，是目前開展抗病育種的首選基因座或候選基因。綿羊主要組織相容 性(基因)復合體也稱為OLA(ovine?lymphocyte?antigen)，OLA?II區與人的相似，區 域內的DQ和DR?2個基因家族表現豐富的多態性，但綿羊的多態性更集中在DQ家族。 OLA-DQ基因家族有2個DQA基因座位，即DQA1和DQA2基因，都具有多態性。

目前國內綿羊腐蹄病主要采用藥物防治措施，較難控制病情且有藥物殘留風險。在 國外OLA-DQA2基因已經作為抗腐蹄病的遺傳標記加以應用，并且該檢測已商業化并用 來開展抗病選育。藏綿羊腐蹄病抗性分子選種技術主要利用PCR-SSCP技術對待測綿羊 的DQA2基因第2外顯子進行多態性分析，然后根據檢測結果確定攜帶不同等位基因的 羊只對腐蹄病的抗性強弱，從而判斷是否可以留作種用。

發明內容：

本發明的目的在于避免現有技術的不足之處而提供一種檢測藏綿羊腐蹄病抗性等 位基因的特異性擴增引物及其引物的擴增條件。

本發明的另一目的是提供一種檢測藏綿羊腐蹄病抗性等位基因檢測試劑盒。

本發明的還有一個目的是提供一種檢測藏綿羊腐蹄病抗性等位基因檢測試劑盒的 使用方法。

以解決快速、敏感性高、成本低用于藏綿羊腐蹄病抗性分子選種技術。

本發明利用PCR-SSCP對表型正常和患腐蹄病藏綿羊OLA-DQA2基因第2外顯子 進行遺傳多態性分析，并克隆、測序群體內變異產生的各等位基因序列，結合表型觀測 資料，確定易感等位基因和抗性等位基因，并指導藏綿羊沒有感染時的抗病選育。

本發明涉及一種藏綿羊腐蹄病抗性等位基因檢測方法及檢測試劑盒。通過 PCR-SSCP對藏綿羊基因組DNA進行檢測，分析羊只是否攜帶腐蹄病抗性等位基因， 從而判斷是否可以留作種用。

本發明的目的可以通過采用以下技術方案來實現：一種檢測藏綿羊腐蹄病抗性等位 基因的特異性擴增引物，其主要特點是第一組引物上游長度為24bp的核苷酸，下游長度 為22bp的核苷酸，第二組引物上游長度為23bp的核苷酸，下游長度為24bp的核苷酸， 包括用于擴增OLA-DQA2基因第2外顯子的特異性引物，序列如下：

上游引物24bp：DQA2-up：CACATGTTACAGTGCAAAARCAGC；

下游引物22bp：DQA2-dn：CCCTCYCACCAACGTTTCCCAG；

上游引物23bp：DQA2s-up：ACTACCAATCTCATGGTCCCTCT；

下游引物24bp：DQA2s-dn：GGAGTAGAATGGTG?GACACTTACC；

其中R＝A或G，Y＝C或T。

所述的檢測藏綿羊腐蹄病抗性等位基因的特異性擴增引物，是所述的PCR-SSCP擴 增引物的擴增條件為：

第一次第一組引物：PCR反應條件：預變性94℃2min，變性94℃30s，退火 64℃30s，延伸72℃50s，共32個循環，最后72℃延伸5min；

第二次第二組引物：PCR反應條件：預變性94℃2min，變性94℃30s，退火 67℃30s，延伸72℃30s，共32個循環，最后72℃延伸5min。

所述的檢測藏綿羊腐蹄病抗性等位基因檢測試劑盒，組成成分用量及濃度為：四種 引物各為0.5μL/10pmol，dNTP為1.2μL/2.5mm，Taq?DNA聚合酶為0.2μL/2.5U/μL， 10×buffer為2.0μL含Mg²⁺15μM，雙純水為14.6μL。